本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌中clpP、clpX及SarZ重要致病基因功能的研究

  更多相關文章： 金黃色葡萄球菌 SarA家族蛋白 CLp蛋白水解酶 細菌雙雜交 同源重組

【摘要】：金黃色葡萄球菌是重要的人類致病菌,酪蛋白裂解酶P(clpP)、酪蛋白裂解酶X(clpX)及葡萄球菌附屬調節(jié)子Z (SarZ)是金黃色葡萄球菌中調節(jié)毒力因子的重要蛋白,clpP蛋白和clpX蛋白屬于CLp蛋白水解酶,在生物體蛋白質代謝過程的調節(jié)和清除不可逆損傷蛋白的過程中發(fā)揮重要作用。SarZ蛋白屬于SarA家族蛋白,是一個二聚體的DNA結合蛋白,它能和特異DNA區(qū)域結合來調控hla(溶血素基因)和附屬基因調節(jié)系統(tǒng)(是S. aureus中最早發(fā)現(xiàn)的毒力因子調控因子之一,agr)。MgrA和SarZ蛋白是同系物都屬于SarA家族蛋白,研究發(fā)現(xiàn)MgrAC12、SarA和SarZC13等蛋白分子半胱氨酸是關鍵的酶活中心,通過半胱氨酸的磷酸化修飾引起了蛋白質結構中氫鍵網(wǎng)絡的變化而導致構象的變化,調節(jié)金黃色葡萄球菌毒力因子的產生以及細菌對萬古霉素的抗性,主要研究結果分為兩部分： 1.clpP蛋白水解酶底物研究 利用同源重組原理在newman基因組中成功敲除clpP基因。 clpP敲除突變體與野生型相比致病性明顯下降。 通過pyj335::clpP質粒構建,進行基因功能互補實驗,恢復到了野生型。 尿素酶瓊脂板結果顯示,尿素酶活性明顯比野生型增加。 通過觀察2%牛奶板,發(fā)現(xiàn)胞外蛋白酶活性也增加了。 利用紅霉素(erm)抗性標記基因,在newman菌株中進行clpX敲除突變菌株的篩選。 利用細菌雙雜交試劑盒,探究clpP和clpX蛋白在細菌體內的相互作用。 2.SarZ蛋白C13的半胱氨酸磷酸化修飾與DNA結合特性及毒力研究 研究表明在SarZ蛋白的C-、N-末端及螺旋轉角螺旋(winged helix-turn-helix motif (wHTH))區(qū)域氨基酸進行一系列的點突變可以改變蛋白與DNA的結合能力。 通過電泳遷移率試驗(EMS A),發(fā)現(xiàn)SarZ (C13E)突變以后能夠減弱蛋白和DNA的結合能力,而SarZ (C13S)提高了與DNA的結合能力。 牛奶板結果也顯示法對SarZ13C進行點突變以后能改變蛋白的折疊方式,造成蛋白特性與功能的改變。 SarZ蛋白中存在的半胱氨酸(cys)磷酸化修飾在金黃色葡萄球菌中是一種新的氧化還原蛋白的翻譯后修飾方式。 通過對SarZ蛋白的研究,類推到SarA家族蛋白-MgrA[最近發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌自溶和毒力調控因子),MgrA C12E進行點突變,研究蛋白結構改變對其功能的影響。ClpP和ClpX蛋白在金黃色葡萄球菌的生理和毒力方面具有重要作用,但對真正ClpP蛋白底物還不是很清楚,有待進一步研究。另外就是金黃色葡萄球菌中,SarZ C13存在的半胱氨酸磷酸化修飾,這種蛋白質的翻譯后修飾作用可能也存于其它SarA家族蛋白,如MgrA和SarA (agr系統(tǒng)的調控因子)這種和SarZ蛋白具有高度氨基酸序列同源性的蛋白中。
【關鍵詞】：金黃色葡萄球菌 SarA家族蛋白 CLp蛋白水解酶 細菌雙雜交 同源重組
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮略詞表(Abbreviation)10-11
• 1 前言11-16
• 2 材料與方法16-37
• 2.1 儀器16
• 2.2 試劑16-17
• 2.3 溶液及培養(yǎng)基的配制17-20
• 2.4 實驗菌株及質粒20-21
• 2.5 引物21-22
• 2.6 實驗方法22-37
• 2.6.1 金黃色葡葡萄球菌基因組提取22
• 2.6.2 大腸桿菌質粒提取22-23
• 2.6.3 金黃色葡菌球菌中質粒提取23-24
• 2.6.4 大腸桿菌的超級感受態(tài)制備24
• 2.6.5 金黃色葡萄球菌感受態(tài)制備24-25
• 2.6.6 構建pkor1：：clpP重組質粒25-27
• 2.6.7 clpP基因敲除27-30
• 2.6.8 細菌雙雜交研究clpP和clpX蛋白互作30-31
• 2.6.9 clpP基因功能互補及過表達31
• 2.6.10 SarZ和MgrA蛋白定點突變31-32
• 2.6.11 噬菌體轉導32-34
• 2.6.12 蛋白純化34
• 2.6.13 蛋白熱穩(wěn)定分析34-35
• 2.6.14 電泳遷移率檢測分析(EMSA)35-37
• 3 實驗結果與分析37-54
• 3.1 clpP基因在newman基因組中的敲除37-42
• 3.1.1 穿梭質粒(△clpP-pkoRl)的構建37-39
• 3.1.2 RN4220修飾39-40
• 3.1.3 重組質粒電擊轉入newman菌株40
• 3.1.4 突變體的篩選40-42
• 3.2 clpX基因在newman基因組中的敲除42
• 3.2.1 pkorl：：clpX-上-erm-下重組質粒的構建42
• 3.2.2 RN4220修飾42
• 3.2.3 △clpX-pKOR1質粒電擊轉入newman42
• 3.2.4 突變體篩選42
• 3.3 clpX/clpP在newman基因組中的雙敲除42-43
• 3.4 Western blot43
• 3.5 △clpP表型特征43-44
• 3.6 細菌雙雜交質粒構建44-46
• 3.7 SarZ/MgrA家族蛋白的研究46-54
• 3.7.1 SarZ做了一些蛋白折疊相關的點突變(18個)46
• 3.7.2 蛋白小試SDS-page46-48
• 3.7.3 電泳遷移率實驗(EMSA)48-50
• 3.7.4 蛋白最適buffer篩選和熱穩(wěn)定性分析50
• 3.7.5 胞外蛋白酶活性檢測50-52
• 3.7.6 在SarZ的基礎上進行另一類SarA家族蛋白—MgrA的研究52-54
• 4 總結與討論54-58
• 參考文獻58-64
• 致謝64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉金鳳;王京蘭;錢小紅;蔡耘;;翻譯后修飾蛋白質組學研究的技術策略[J];中國生物化學與分子生物學報;2007年02期

2 李建華;陳利玉;;細菌雙雜交系統(tǒng)及其在病原微生物學中的應用[J];微生物學免疫學進展;2006年03期

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本文編號：1053084