本文關鍵詞：空腸彎曲菌cdtB和cdtC原核表達及其產物的單克隆抗體制備

  更多相關文章： 空腸彎曲菌 細胞致死性腫脹毒素 CdtB CdtC蛋白 ELISA方法 單克隆抗體

【摘要】：空腸彎曲菌是引起世界各地急性胃腸炎的主要病原菌。感染的病人除了表現(xiàn)出急性、自限性腹瀉外,特定血清型的空腸彎曲菌能引起自身免疫疾病,如格林-巴利綜合癥(GBS)。空腸彎曲菌有許多致病因子如：黏附、侵襲和產毒素,細胞致死性腫脹毒素(Cytolethal distendin toxin, CDT)是一種由革蘭氏陰性細菌產生的細菌外毒素,空腸彎曲菌也能產生這種毒素。CDT由三個相鄰的cdtA、cdtB和cdtC編碼。CDT毒素具有細胞毒性,能夠損傷真核細胞的DNA,使細胞周期阻滯在G2/M期,最終使受損傷的細胞腫脹死亡。目前,對空腸彎曲菌細胞致死性腫脹毒素功能機理等研究還不夠深入。本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達cdtB、cdtC基因,純化His-CdtB、His-CdtC、GST-CdtC蛋白,以His-CdtB蛋白為基礎,建立檢測空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法；同時以GST-CdtB的包涵體和GST-CdtC蛋白為免疫原；His-CdtB, His-CdtC蛋白為檢測原,利用淋巴細胞雜交瘤技術,制備CdtB和CdtC的單克隆抗體,為CDT毒素功能、診斷技術等方面的研究奠定基礎。 一、空腸彎曲菌細胞致死性腫脹毒素cdtB、cdtC的原核表達 根據GenBank上公布的空腸彎曲菌NCTC11168的cdtB和cdtC基因序列設計引物。擴增不含信號序列的2個基因,并與pMD-18T載體連接,酶切、測序鑒定正確后,將cdtB基因連接到表達載體pET(30a)和pGEX-6p-1,獲得重組菌BL21(pET-cdtB)和BL21(pGEX-6p-l-cdtB);將cdtC基因連接到表達載體pET(32a)和pGEX-6p-1,獲得重組菌BL21(pET-cdtC)和BL21(pGEX-6p-l-cdtC)。經IPTG誘導后,離心收集菌體,進行SDS-PAGE鑒定。SDS-PAGE結果顯示表達的蛋白與預期大小一致,His-CdtB、GST-CdtB大小為分別為29KD、53KD; His-CdtC、GST-CdtC大小分別為36KD、47KD。利用蛋白質的變復性獲得純化的蛋白His-CdtB和GST-CdtC,利用親和層析柱純化獲得His-CdtC。Western-blot實驗結果顯示融合蛋白具有良好的免疫反應性。 二、基于CdtB蛋白檢測空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及初步應用 以純化的His-CdtB作為包被原,用NCTC11168攻毒獲得的血清作為陽性血清,建立了檢測空腸彎曲菌CdtB抗體的間接ELISA方法,以方陣實驗對ELISA條件進行優(yōu)化,最終確定了ELISA反應條件：抗原包被濃度為16μg/mL;封閉液為10%的馬血清；封閉時間為37℃,2h；最佳血清稀釋液為PBS；血清稀釋倍數(shù)為1：200；一抗作用時間為2h；二抗作用濃度為1：10000,作用時間為1h;顯色時間為4min。應用優(yōu)化的ELISA方法對60份雞的血清樣品進行測定,并采集相對應的雞肛拭樣品,進行細菌分離。結果顯示分離到20份空腸彎曲菌,對分離株進行cdtB基因檢測,18份呈陽性；ELISA檢測有14份為陽性,2種實驗方法的符合率為78%;應用建立的方法對388份人的血清樣品進行測定,34份呈陽性,陽性率為8.76%。該檢測方法的建立對空腸彎曲菌的血清流行病學研究等提供了新方法。 三、CdtB和CdtC單克隆抗體的制備和初步應用 以原核表達的GST-CdtB和GST-CdtC蛋白為免疫原,以His-CdtB、His-CdtC分別為檢測原,應用淋巴細胞雜交瘤技術制備單克隆抗體。獲得5株穩(wěn)定分泌CdtB抗體的細胞株,分別命名為1F3、1F5、2E4、2E11、2F2,2E11,單抗亞類為IgG2b,其它4株均為IgGl,腹水效價分別為1：3276800、1：6553600、1：819200、1：6553600、1：13107200；獲得5株穩(wěn)定分泌CdtC抗體的細胞株,分別命名為3A10、4D2、2E1、6E4、3G5,單抗亞類均為IgG1；腹水效價分別為1：6553600、1：3276800、1：1638400、1：13107200、1：1638400。Western-blot分析顯示,每株單抗都能與相對應的融合蛋白發(fā)生發(fā)應,并出現(xiàn)特異性的條帶,說明單抗具有良好的特異性。 選擇Caco-2和HD-11細胞為模型,將2種抗體與NCTC11168中和1h后進行黏附和侵襲實驗。結果顯示,對于HD-11細胞,與2種抗體作用后的細菌的黏附和侵襲能力相對于對照組明顯下降,加入CdtB抗體黏附率和侵襲率分別下降了28%、11%：加入CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了27%、32%;同時加入CdtB和CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了30%、47%；侵染HD-11細胞后的形態(tài)觀察和細胞數(shù)目測定顯示,只加入NCTC11168細菌的對照組的活細胞數(shù)為6.8×15個/mL；加入CdtB抗體后,活細胞數(shù)為1.4×106個/mL；加入CdtB和CdtC抗體后,活細胞數(shù)為2.6×106個/mL,加入抗體后的細胞存活率高于對照組。對照組的細胞明顯腫脹,而加入抗體后的細胞腫脹數(shù)明顯減少。對于Caco-2細胞,加入CdtB抗體,細菌的黏附和侵襲分別下降了73%、70%；加入CdtC抗體,細菌的黏附和侵襲分別下降了68%、70%;加入CdtB和CdtC抗體細菌的黏附和侵襲分別下降了71%、75%。研究顯示CdtB和CdtC抗體具有一定的中和毒素的能力,加入抗體后能干擾細菌的黏附和侵襲能力。CdtB和CdtC單克隆抗體的制備為研究CdtB和CdtC蛋白的生物學功能和臨床應用等方面奠定了基礎。
【關鍵詞】：空腸彎曲菌 細胞致死性腫脹毒素 CdtB CdtC蛋白 ELISA方法 單克隆抗體
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-8
• 目錄8-10
• 符號說明10-12
• 綜述 細胞致死性腫脹毒素12-23
• 1 編碼和/或產生CDT的細菌種類12-13
• 1.1 大腸桿菌12
• 1.2 志賀氏菌12-13
• 1.3 空腸彎曲桿菌13
• 1.4 其他細菌13
• 2 CDT的遺傳學13-14
• 3 CDT結構14
• 4 CDT各組成部分的功能14-16
• 4.1 CdtB的功能14-15
• 4.2 CdtA/CdtC的功能15-16
• 5 CDT的作用機制16-17
• 6 CDT影響的細胞類型17
• 7 CDT作為一個可能的致病因素17-18
• 8 展望18
• 參考文獻18-23
• 第一章 空腸彎曲菌細胞致死性腫脹毒素cdtB、cdtC的原核表達23-34
• 1 材料與方法23-26
• 1.1 材料23-24
• 1.2 方法24-26
• 2 結果26-31
• 2.1 cdtB和cdtC基因擴增26-27
• 2.2 PCR產物與克隆載體的連接27
• 2.3 重組原核表達質粒pET-cdtB、pGEX-6p-1-cdtB、pET-cdtC、pGEX-6p-1-cdtC的構建與鑒定27-28
• 2.4 cdtB,cdtC基因在重組菌中的表達28-31
• 3 討論31-32
• 參考文獻32-34
• 第二章 基于CdtB蛋白檢測空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及初步應用34-47
• 1 材料與方法34-36
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-36
• 2 結果36-45
• 2.1 CdtB蛋白的同源性分析36-37
• 2.2 陽性血清的制備37
• 2.3 蛋白包被濃度、血清稀釋度的確定37-38
• 2.4 封閉液的選擇38-39
• 2.5 封閉時間的確定39-40
• 2.6 血清稀釋液的選擇40
• 2.7 血清作用時間的確定40-41
• 2.8 二抗稀釋度的確定41-42
• 2.9 二抗作用時間的確定42
• 2.10 顯色時間的確定42-43
• 2.11 間接ELISA方法步驟的確定43
• 2.12 特異性實驗43-44
• 2.13 重復性實驗44
• 2.14 間接ELISA方法的初步應用44-45
• 3 討論45-46
• 參考文獻46-47
• 第三章 CdtB和CdtC單克隆抗體的制備和初步應用47-61
• 1 材料和方法47-51
• 1.1 材料47-48
• 1.2 方法48-51
• 2 結果51-58
• 2.1 間接ELISA檢測方法的建立51-52
• 2.2 雜交瘤細胞株的建立52
• 2.3 單抗亞類、上清和腹水效價的測定結果52-53
• 2.4 單抗Western-blot試驗53-54
• 2.5 中和抗體的選擇54-55
• 2.6 基于CaCo-2細胞的黏附和侵襲實驗55-56
• 2.7 基于HD-11細胞的黏附和侵襲實驗56
• 2.8 HD-11細胞形態(tài)和細胞數(shù)目的變化56-58
• 3 討論58-60
• 參考文獻60-61
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文目錄61-62
• 致謝62-63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前5條

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本文編號：1038715