本文關鍵詞：T細胞CD59GPI對LAT脂筏內(nèi)移位及跨膜信號轉導的作用機制研究

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【摘要】：目的構建T細胞活化連接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表達載體,以及利用基因點突變技術使LAT-EGFP的棕櫚�；稽c突變構建LAT-EGFP-M真核表達載體,并將兩種真核表達載體轉染入Jurkat細胞中穩(wěn)定表達,研究CD59在T細胞信號轉導過程中與LAT的相互作用,探討CD59向胞內(nèi)傳遞信號的機制。 方法從人T細胞白血病細胞Jurkat細胞中提取總RNA,利用RT-PCR的方法擴增LAT基因,構建LAT-EGFP真核表達載體,并利用點突變技術使LAT-EGFP近膜處的棕櫚�；稽c的絡氨酸替換為甘氨酸,構建棕櫚酰化位點突變的LAT-EGFP-M真核表達載體：采用電轉染的方法轉染Jurkat細胞,雙抗交聯(lián)CD59后,熒光共聚焦顯微鏡下觀察LAT分布情況的變化：用噻唑藍(MTT)比色法檢測抗體交聯(lián)前各組后Jurkat細胞增殖情況差別；應用ELISA檢測各組細胞上清中IL-2的變化水平；用Western blot技術檢測抗體交聯(lián)后LAT-EGFP和LAT-EGFP-M的磷酸化程度。 結果經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、western blot技術及測序鑒定LAT-EGFP真核表達載體和LAT-EGFP-M構建成功；抗體交聯(lián)CD59之后,LAT-EGFP-M較LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏區(qū)域,并且轉染了突變LAT-EGFP-M質(zhì)粒的Jurkat細胞增增速度和IL-2分泌能力低于轉染LAT-EGFP質(zhì)粒的對照組。轉染空載體EGFP-N3及未轉染的細胞,LAT-EGFP-M的磷酸化程度遠低]LAT-EGFP。 結論LAT參與CD59信號轉導過程,并且二者作用位點與棕櫚酰化基團有關。這為研究CD59類GPI錨固蛋白的信號轉導方式奠定了基礎。
【關鍵詞】：CD59 T細胞活化連接蛋白 棕櫚酰化 T淋巴細胞
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-7
• 第1章 材料與方法7-20
• 1.1 材料7-8
• 1.1.1 主要儀器設備7
• 1.1.2 質(zhì)粒、菌株與細胞株7
• 1.1.3 主要實驗試劑7-8
• 1.2 方法8-20
• 1.2.1 LAT-EGFP重組質(zhì)粒的構建8-15
• 1.2.1.1 PCR擴增引物的設計8
• 1.2.1.2 Jurkat細胞的培養(yǎng)8
• 1.2.1.3 Jurkat細胞內(nèi)總RNA的提取8-9
• 1.2.1.4 目的基因的擴增9-10
• 1.2.1.5 LAT-T重組克隆載體的構建及鑒定10-12
• 1.2.1.6 LAT-EGFP重組載體的構建和鑒定12-15
• 1.2.2 Jurkat細胞的轉染15-17
• 1.2.2.1 Jurkat細胞的培養(yǎng)15
• 1.2.2.2 Jurkat細胞的電轉染15-16
• 1.2.2.3 轉染細胞陽性克隆的鑒定16-17
• 1.2.3 功能檢測17-19
• 1.2.3.1 Jurkat細胞固定觀察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M與CD59在細胞膜上的自然分布情況17-18
• 1.2.3.2 抗體交聯(lián)CD59后激光共聚焦顯微鏡下觀察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M與CD59在細胞膜上的分布變化18
• 1.2.3.3 MTT比色法檢測Jurkat細胞增殖活性18
• 1.2.3.4 IL-2 ELISA的檢測18-19
• 1.2.3.5 Western blot法檢測19
• 1.2.4 統(tǒng)計學分析19-20
• 第2章 實驗結果20-27
• 2.1 LAT-EGFP重組真核表達載體的構建20-22
• 2.1.1 LAT基因片段的擴增20
• 2.1.2 LAT-T克隆載體的PCR及酶切鑒定20-21
• 2.1.3 PEGFP-N3-Linker的單酶切鑒定21
• 2.1.4 陽性重組質(zhì)粒LAT-EGFP的PCR及酶切鑒定21-22
• 2.2 重組質(zhì)粒轉染Jurkat細胞及鑒定22-24
• 2.2.1 重組質(zhì)粒電轉染Jurkat細胞后觀察熒光量表達22
• 2.2.2 LAT-EGFP融合基因在RNA水平上的表達鑒定22-23
• 2.2.3 共聚焦顯微鏡下觀察LAT-EGFP的分布23
• 2.2.4 Western blot鑒定融合蛋白的表達23-24
• 2.3 功能檢測結果24-27
• 2.3.1 轉染后固定的Jurkat細胞上CD59和LAT-EGFP,LAT-EGFP-M分布情況24-25
• 2.3.2 抗體交聯(lián)CD59后觀察膜上分子的分布變化25
• 2.3.3 MTT檢測結果25-26
• 2.3.4 IL-2 ELISA檢測結果26
• 2.3.5 Western blot的結果26-27
• 第3章 討論27-30
• 結論30-31
• 參考文獻31-34
• 綜述34-45
• 綜述參考文獻40-45
• 攻讀學位期間的研究成果45-46
• 附錄146-50
• 附錄250-52
• 致謝52-53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1032785