本文關鍵詞：構建大鼠白細胞介素1β基因shRNA及過表達腺病毒載體

  更多相關文章： 神經(jīng)病理性疼痛 白細胞介素1β RNA干擾 短發(fā)卡RNA 腺病毒載體

【摘要】：目的:神經(jīng)病理性疼痛是目前麻醉工作中常見的一種難治性的慢性疼痛,其具體的發(fā)生及發(fā)展機制十分復雜,有眾多的細胞因子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)參與其中。研究表明,白細胞介素1β(IL-1β)是其中一種起主要作用的細胞因子,其在體內(nèi)表達水平的上升是誘導產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的重要因素。特異性下調(diào)體內(nèi)IL-1β蛋白的表達水平能夠有效緩解由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后直接導致的神經(jīng)病理性疼痛。采用基因治療領域的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術可以在基因水平下調(diào)IL-1β在體內(nèi)的表達。其具體原理是通過設計并合成IL-1β特異性的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA),在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制目的蛋白的表達。與si RNA相比,短發(fā)卡狀RNA(short hairpin RNA,sh RNA)可以更加穩(wěn)定、高效地抑制目的蛋白的表達,但是單純的sh RNA并無法高效地進入靶細胞中發(fā)揮對目的蛋白的下調(diào)作用,因此必須借助一定的載體。而腺病毒載體的特點是可以感染大多數(shù)的細胞,并且其感染效率較高以及能夠在宿主細胞中穩(wěn)定表達等特點。因此,本實驗中通過構建IL-1β的sh RNA腺病毒載體以及過表達腺病毒載體來觀察其對目的蛋白表達水平的影響,從而進一步為麻醉工作中神經(jīng)病理性疼痛的診治提供一種有效措施。具體目的是構建大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體以及過表達腺病毒載體并檢測其對目的蛋白表達水平的影響。方法:構建IL-1β的sh RNA腺病毒載體:根據(jù)NCBI中查詢獲得的大鼠IL-1β基因序列設計3條si RNA并合成相應的sh RNA,分別為sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3。將采用3’和5’單鏈退火得到的sh RNA基因產(chǎn)物和經(jīng)過Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切的p HBAd/U6/GFP載體連接,構建IL-1βsh RNA腺病毒載體穿梭質(zhì)粒。之后將得到的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大鼠感受態(tài)細胞DH5α,在培養(yǎng)皿中挑菌后將菌液交與上海尼桑生物技術有限公司對其中的基因序列進行測定。測序完成后將穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒(p HBAd/BHG)共轉(zhuǎn)染HEK(人胚腎)293細胞,進行IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體(r Ad/sh RNAs)的包裝與擴增,所得產(chǎn)物分別為r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3。將r Ad/sh RNAs感染培養(yǎng)好的大鼠H9C2細胞,使用熒光顯微鏡觀察其對細胞的感染效率,然后采用Western Blot測定r Ad/sh RNAs對目的蛋白表達水平的影響。構建IL-1β的過表達腺病毒載體:通過NCBI查詢得到大鼠IL-1β的基因序列,設計引物并使用PCR技術擴增其CDS(Coding sequence)區(qū)。取p HBAd/MCMV/RFP干擾載體,與得到的基因片段均采用Eco RI和Not I雙酶切處理。酶切之后,將擴增的基因片段與干擾載體相連接,構建大鼠IL-1β的過表達腺病毒載體穿梭質(zhì)粒。之后將構建完成的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,在培養(yǎng)皿中挑菌后將產(chǎn)物交與上海尼桑生物技術有限公司對其中的基因序列進行測定。序列測定完成后將構建好的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒(p HBAd/BHG)共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,進行IL-1β過表達腺病毒載體(r Ad/IL-1β)的包裝與擴增。最后將構建完成的r Ad/IL-1β感染培養(yǎng)好的大鼠H9C2細胞,使用熒光顯微鏡觀察其對宿主細胞的感染效率,采用Western Blot驗證IL-1β的過表達。結果:測序結果顯示IL-1β基因的3條sh RNA腺病毒載體穿梭質(zhì)粒中的序列分別與所設計的3條sh RNA序列相同;過表達腺病毒載體穿梭質(zhì)粒中的序列與NCBI中查詢獲得的大鼠IL-1β的基因序列相同。成功構建了大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體(r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3)和過表達腺病毒載體(r Ad/IL-1β)。r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3均可以下調(diào)IL-1β蛋白的表達,其中r Ad/sh RNA2的下調(diào)效果最明顯,而r Ad/IL-1β則可以明顯上調(diào)IL-1β蛋白的表達。結論:大鼠白細胞介素1β基因的sh RNA腺病毒載體的應用為臨床麻醉工作中對于神經(jīng)病理性疼痛的治療提供了一種新的思路,表明了基因治療技術在疼痛治療領域中也具有廣闊的應用前景。
【關鍵詞】：神經(jīng)病理性疼痛 白細胞介素1β RNA干擾 短發(fā)卡RNA 腺病毒載體
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用縮寫詞中英文對照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-25
• 1.1 主要實驗材料14-17
• 1.2 常用緩沖液的配制方法17-18
• 1.3 實驗方法18-23
• 1.4 主要觀察指標23-24
• 1.5 統(tǒng)計學分析24-25
• 2 結果25-30
• 2.1 IL-1β 的shRNA及過表達腺病毒載體穿梭質(zhì)粒的構建25
• 2.2 腺病毒載體感染效率的鑒定25-27
• 2.3 Western Blot檢測rAd/shRNAs對IL-1β 表達水平的影響27-29
• 2.4 Western Blot檢測r Ad/IL-1β 對目的蛋白表達水平的影響29-30
• 3 討論30-33
• 4 結論33-34
• 參考文獻34-38
• 綜述38-49
• 參考文獻44-49
• 致謝49-50
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳杰;;外周血IL-1β和IL-6水平與腰椎間盤突出癥腰腿痛疼痛程度的臨床研究[J];實用預防醫(yī)學;2012年12期

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本文編號：975815