本文關(guān)鍵詞：新烷化劑替莫唑胺酯抗腦膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:1.考察新烷化劑替莫唑胺酯(TMZ-HE)體外對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。2.進(jìn)一步考察TMZ-HE對(duì)TMZ耐藥細(xì)胞系的抑制作用3.初步探討TMZ-HE抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和克服TMZ耐藥的作用機(jī)制。方法:1.為檢測(cè)TMZ-HE體外對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用效果,選取三種MGMT表達(dá)水平不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,采用MTT比色法檢測(cè)TMZ-HE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G,LN229和LN-18的增殖抑制作用;利用克隆形成能力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMZ-HE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN-18克隆形成的影響;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMZ-HE誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生率;2.為進(jìn)一步驗(yàn)證TMZ-HE克服腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對(duì)TMZ耐藥的作用,首先通過(guò)慢病毒感染法構(gòu)建高表達(dá)MGMT的LN229/MGMT耐藥細(xì)胞系,再通過(guò)藥物分期誘導(dǎo)建立不表達(dá)MGMT的耐藥細(xì)胞系SHG-44/TMZ;采用Western Blot法鑒定LN229/MGMT和SHG-44/TMZ兩種耐藥細(xì)胞系中MGMT的表達(dá)情況后,利用MTT比色法檢測(cè)TMZ-HE對(duì)耐藥細(xì)胞系LN229/MGMT和SHG-44/TMZ的增殖抑制作用;3.為初步探討TMZ-HE的作用機(jī)制,檢測(cè)TMZ-HE對(duì)耐藥蛋白MGMT的影響以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制;通過(guò)Western Blot檢測(cè)藥物處理后T98G細(xì)胞中耐藥蛋白MGMT表達(dá)、LN229,T98G細(xì)胞中DNA損傷指標(biāo)γH2AX蛋白表達(dá)以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMZ-HE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響;結(jié)果:1.TMZ-HE對(duì)MGMT表達(dá)水平不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系都具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用,且體外作用效果優(yōu)于TMZ。1)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,T98G細(xì)胞中耐藥蛋白MGMT表達(dá)量最高,其次為L(zhǎng)N-18細(xì)胞,敏感細(xì)胞系LN229中不表達(dá)耐藥蛋白MGMT。2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TMZ-HE能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229,LN-18和T98G的增殖,且抑制作用優(yōu)于TMZ,說(shuō)明,TMZ-HE對(duì)MGMT不同表達(dá)水平的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用均優(yōu)于TMZ。3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明TMZ,TMZ-HE能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,藥物作用96h其凋亡率隨藥物濃度增加不斷增加,200,400μmol/L的TMZ-HE誘導(dǎo)LN229,T98G細(xì)胞的凋亡率明顯高于TMZ,結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.TMZ-HE一定程度上能夠克服TMZ耐藥,特別是MGMT高表達(dá)的耐藥細(xì)胞。1)膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞的建立:Western blot結(jié)果顯示LN229/MGMT細(xì)胞中高表達(dá)MGMT,SHG-44/TMZ細(xì)胞中不表達(dá)MGMT。2)TMZ-HE和TMZ對(duì)原發(fā)及獲得性耐藥細(xì)胞增殖抑制作用的比較:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,①TMZ-HE對(duì)高表達(dá)MGMT的原發(fā)耐藥細(xì)胞系T98G和獲得性耐藥細(xì)胞系LN229/MGMT的增殖抑制作用優(yōu)于TMZ,對(duì)MGMT不表達(dá)的耐藥細(xì)胞系SHG-44/TMZ的增殖抑制作用同樣優(yōu)于TMZ(P0.05);②TMZ-HE和TMZ對(duì)不表達(dá)MGMT的耐藥細(xì)胞系SHG-44/TMZ增殖抑制作用不如表達(dá)MGMT的耐藥細(xì)胞系。TMZ-HE對(duì)耐藥細(xì)胞系的增殖抑制作用由大到小為L(zhǎng)N229/MGMTT98GSHG-44/TMZ。3.針對(duì)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的幾個(gè)可能作用機(jī)制,TMZ-HE與TMZ對(duì)其關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)趨勢(shì)相似,但TMZ-HE的調(diào)節(jié)作用明顯高于TMZ。1)增加DNA損傷指標(biāo)γH2AX的表達(dá)量:TMZ、TMZ-HE作用LN229、T98G細(xì)胞后,均能導(dǎo)致DNA損傷指標(biāo)γH2AX的表達(dá)量增加。2)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡:TMZ和TMZ-HE均通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。3)細(xì)胞周期阻滯:TMZ和TMZ-HE能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯,但400μmol/L的TMZ-HE還能導(dǎo)致細(xì)胞的S期發(fā)生阻滯。4)下調(diào)耐藥蛋白對(duì)MGMT表達(dá)量:Western blot法檢測(cè)TMZ、TMZ-HE處理T98G后MGMT蛋白的表達(dá)量,其結(jié)果表明,兩種藥物均能下調(diào)MGMT的表達(dá)量,但與TMZ相比,TMZ-HE對(duì)MGMT表達(dá)量的下調(diào)作用表現(xiàn)得更強(qiáng)也更快速。結(jié)論:1.TMZ-HE能夠抑制敏感和原發(fā)性耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,同時(shí)能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,其增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用效果都優(yōu)于TMZ。2.TMZ-HE對(duì)耐藥蛋白MGMT的抑制活性明顯的高于TMZ。,在一定程度上克服了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的原發(fā)和獲得性耐藥。3.TMZ-HE抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與TMZ相似,既可通過(guò)造成DNA損傷,又可通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2及上調(diào)促凋亡基因Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,兩者還具有G2期阻滯作用;但是TMZ-HE對(duì)耐藥蛋白MGMT的抑制活性明顯高于TMZ,這可能與TMZ-HE的作用效果優(yōu)于TMZ有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：替莫唑胺 替莫唑胺酯 細(xì)胞凋亡 Bax
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明12-13
• 前言13-19
• 研究現(xiàn)狀、成果13-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、TMZ-HE對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤體外的抑制作用19-43
• 1.1 對(duì)象和材料19-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象19
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料19
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器19
• 1.1.4 主要試劑配制19-20
• 1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法20
• 1.2 方法20-26
• 1.3 結(jié)果26-40
• 1.3.1 LN229, T98G, LN18細(xì)胞中耐藥蛋白MGMT的表達(dá)量26
• 1.3.2 TMZ-HE對(duì)LN229,T98G及LN-18細(xì)胞增殖抑制的作用26-29
• 1.3.3 TMZ-HE對(duì)LN229,T98G及LN-18細(xì)胞克隆形成的影響29-32
• 1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和死亡率32-40
• 1.4 討論40-42
• 1.5 小結(jié)42-43
• 二、TMZ-HE對(duì)獲得性耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用43-51
• 2.1 對(duì)象和材料43-44
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象43
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料43
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器43
• 2.1.4 主要試劑配制43-44
• 2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法44
• 2.2 方法44-47
• 2.3 結(jié)果47-49
• 2.3.1 獲得性耐藥細(xì)胞系LN229/MGMT的建立47
• 2.3.2 獲得性耐藥細(xì)胞系SHG-44/TMZ的建立47-48
• 2.3.3 TMZ-HE對(duì)耐藥細(xì)胞系T98G, LN229-MGMT, SHG-44/TMZ細(xì)胞的增殖抑制作用48-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 三、TMZ-HE對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用的機(jī)制51-61
• 3.1 對(duì)象和材料51-52
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象51
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料51
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器51-52
• 3.1.4 主要試劑配制52
• 3.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法52
• 3.2 方法52-54
• 3.3 結(jié)果54-58
• 3.3.1 TMZ-HE導(dǎo)致LN229, T98G細(xì)胞中DNA損傷指標(biāo) γH2AX蛋白表達(dá)升高54-55
• 3.3.2 TMZ-HE能夠?qū)е履z質(zhì)瘤LN229, T98G細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 蛋白表達(dá)降低、Bax蛋白表達(dá)增加55-56
• 3.3.3 TMZ-HE能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生S和G2期阻滯56-57
• 3.3.4 TMZ-HE能夠使T98G細(xì)胞中耐藥蛋白MGMT表達(dá)含量降低57-58
• 3.4 討論58-60
• 3.5 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明67-68
• 綜述 有關(guān)替莫唑胺耐藥因素的研究進(jìn)展68-77
• 綜述參考文獻(xiàn)74-77
• 致謝77

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本文編號(hào)：702028