本文關(guān)鍵詞：srGAP3在大腦皮層神經(jīng)元MMDA興奮毒性損傷中的作用

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【摘要】：神經(jīng)元興奮毒性損傷學(xué)說是在1969年由Olney等人提出,用于闡述谷氨酸持續(xù)或過度刺激谷氨酸受體而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡的現(xiàn)象。近半個世紀(jì)來,大量的實驗研究證明,興奮毒性損傷學(xué)說是神經(jīng)元損傷及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要機(jī)制之一,中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷及多種神經(jīng)元進(jìn)行性退行疾病都存在興奮毒性作用,包括中風(fēng)、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、亨丁頓舞蹈癥、癲癇等。它涉及的分子機(jī)制和信號通路十分復(fù)雜,目前比較明確的包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,鈣、鈉、鉀、氯等離子的異常動員,線粒體功能障礙,溶酶體不穩(wěn)定,而上述這些事件的發(fā)生促發(fā)了自由基的大量生成、蛋白酶和蛋白激酶的激活、促死亡基因的表達(dá),從而最終導(dǎo)致神經(jīng)元以自噬、凋亡、壞死等不同形式結(jié)局。研究興奮毒性損傷的發(fā)生機(jī)制是為了尋找可行的阻斷策略和治療手段,針對上述分子機(jī)制和信號通路的各類藥物正被逐漸地研發(fā),主要有谷氨酸受體的拮抗劑、谷氨酸釋放的阻斷劑、自由基清除劑及抗氧化劑、一氧化氮合酶抑制劑等。谷氨酸受體拮抗劑主要包括MK-801(Dizolcipine,地佐環(huán)平/地卓西平)、美金剛(Memantine)、NBQX等；谷氨酸釋放阻斷劑有BW619C89、利魯唑等；自由基清除劑及抗氧化劑有α-苯基叔丁基硝酮N (PBN)、Tirilazad等；一氧化氮合酶抑制劑有7-硝基吲唑。但是,這眾多的藥物中,除了美金剛被批準(zhǔn)應(yīng)用于治療中重度至重度阿爾茨海默型癡呆,利魯唑被用于治療肌萎縮側(cè)索硬化癥患者以外,其他藥物或因為副作用過大、或因為臨床試驗療效不明確、或因未能在中樞系統(tǒng)中起作用而停止在走向臨床治療的路上。截止目前,阻斷神經(jīng)元興奮毒性發(fā)生、挽救神經(jīng)元死亡的藥物仍然匱乏,有待研發(fā)。Rho GTPase屬于小G蛋白超家族的亞家族成員,其主要的成員包括：Rac1、 Cdc42、RhoA,它們存在于所有的真核細(xì)胞當(dāng)中,并參與了廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架,調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、粘附、遷移、侵襲、吞噬、細(xì)胞存活等過程中扮演著重要的角色。Rho GTPase在細(xì)胞內(nèi)有兩種狀態(tài),一種是與GTP結(jié)合的激活狀態(tài),一種是與GDP結(jié)合的失活狀態(tài)。它們的激活和失活狀態(tài)轉(zhuǎn)換在細(xì)胞內(nèi)受三類因子調(diào)控：鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)、GTP酶激活蛋白(GAPs)以及鳥嘌呤核苷酸交換因子抑制因子(GDIs)。GEFs催化RhoGTPase從GDP結(jié)合的失活狀態(tài)變?yōu)镚TP結(jié)合的激活狀態(tài)；而GAPs則催化GTP水解,將Rho GTPase從GTP結(jié)合的激活狀態(tài)變?yōu)镚DP結(jié)合的失活狀態(tài)；GDIs與失活狀態(tài)的Rho GTPase結(jié)合,使其穩(wěn)定于失活狀態(tài)。研究表明,Rho GTPase參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活。在大鼠的交感神經(jīng)元中表達(dá)有活性的Rac1或Cdc42可以促進(jìn)神經(jīng)生長因子(NGF)因撤藥引起的細(xì)胞凋亡,若過表達(dá)帶突變結(jié)構(gòu)域的(無活性)Rac1或Cdc42則可以阻斷這種類型的細(xì)胞凋亡。Semenova等在2007年報道,RhoA在神經(jīng)元興奮毒性過程中活性顯著升高,并介導(dǎo)隨后的細(xì)胞死亡。這些研究從全細(xì)胞水平闡述了Rho GTPase在神經(jīng)細(xì)胞存活過程中的作用,但Rho GTPase在亞細(xì)胞水平的激活變化情況及其對神經(jīng)細(xì)胞存亡的作用仍有待研究。srGAPs,全稱Slit-Robo GTP酶激活蛋白,是Rho GAPs的亞家族成員,是Robo受體的下游信號分子,它的主要成員包括srGAP 1、srGAP2、srGAP3。srGAPs在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著十分重要的作用,介導(dǎo)軸突的生長方向和投射通路的形成,參與神經(jīng)元芽生、神經(jīng)細(xì)胞遷移和神經(jīng)細(xì)胞分布。srGAP1的SH3結(jié)構(gòu)域可與Robol的CC3結(jié)構(gòu)域結(jié)合,使Rho GTPase家族的Cdc42失活,從而影響細(xì)胞骨架蛋白及引起肌動蛋白在細(xì)胞的不對稱分布,最終引起神經(jīng)細(xì)胞遷移和神經(jīng)元軸突伸展方向變化。srGAP2的Rho GAP結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)有活性的Rac1水解失活,從而抑制神經(jīng)元的遷移。srGAP3由F-BAR, GAP和SH3三個結(jié)構(gòu)域組成。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞株,srGAP3通過F-BAR結(jié)構(gòu)域附著在質(zhì)膜上,及通過它的SH3結(jié)構(gòu)域形成粘著斑。它的Rho GAP結(jié)構(gòu)域可以抑制Rac1的活性,過表達(dá)srGAP3可以損傷肌動蛋白和微管活力,從而影響細(xì)胞突起的形成和細(xì)胞的粘附,使細(xì)胞變圓、偽足減少、遷移受損。srGAP3又被稱為精神發(fā)育遲緩相關(guān)蛋白(Mental disorder-associated GAP protein, MEGAP),在精神發(fā)育遲緩3p綜合征患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,可以檢測出srGAP3被破壞。srGAP3還可與Arp2/3激活蛋白Wave-1結(jié)合形成Wave-1/srGAP3復(fù)合物,參與海馬神經(jīng)元的樹突棘發(fā)育、突觸可塑性等過程并在長時程記憶形成過程中起著重要作用。srGAP3廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同的組織中,在大腦皮層呈高表達(dá)。近年來,srGAP3的其他功能在逐漸地被研究和認(rèn)識。在人乳腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)srGAP3,可使癌細(xì)胞增殖能力及侵襲能力降低；核定位的srGAP3可與核小體重塑復(fù)合物SWI/SNF重塑因子Brgl相互作用,可能參與了調(diào)控基因表達(dá)。在神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞下調(diào)srGAP3的表達(dá),可引起細(xì)胞凋亡。但srGAP3是否參與成熟神經(jīng)元存活調(diào)控尚未清楚。我們感興趣的問題是：srGAP3的表達(dá)水平在神經(jīng)元興奮毒性過程中是否發(fā)生變化?干擾它的表達(dá)水平是否能改變神經(jīng)元存亡的結(jié)局呢?它在興奮毒性過程中的下游信號分子是否為Rho GTPase呢?為了回答上述問題,我們首先在NMDA誘導(dǎo)的培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元(12-15天)興奮毒性模型上檢測了NMDA處理后0h、1h、3h、6h時全細(xì)胞蛋白水平srGAP3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NMDA處理后1h、3h、6h, srGAP3表達(dá)隨時間逐漸下降。下一步,在培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元,用靶向irGAP3基因的小發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒載體敲減srGAP3表達(dá),檢測其是否影響NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢病毒shRNA不引起正常神經(jīng)元死亡,并且慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)對NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡具有保護(hù)作用。srAP3在皮層神經(jīng)元的胞漿和胞核均有表達(dá),而上述研究結(jié)果表明,srGAP3在興奮毒性發(fā)生過程中,全細(xì)胞的表達(dá)水平是呈下降趨勢的,而用慢病毒shRNA進(jìn)一步使其表達(dá)水平下降,它卻表現(xiàn)出了神經(jīng)元保護(hù)的作用。為了探明其中的分子機(jī)制,我們給予小鼠培養(yǎng)皮層神經(jīng)元NMDA刺激后,分別于0h、 1h、3h、6h時提取胞漿和胞核蛋白,檢測srGAP3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞漿,srGAP3的表達(dá)水平在1 h、3h和6h時,隨時間顯著下降,這與全細(xì)胞的表達(dá)水平趨勢一致；而在細(xì)胞核,srGAP3的表達(dá)水平在0h、1h顯著上升,3h和6h時表達(dá)水平與對照無差別。在興奮毒性過程中,srGAP3在胞漿和胞核表達(dá)水平變化趨勢的不一致這一結(jié)果提示srGAP3可能在這個過程中在胞漿和胞核扮演著不同的角色。然后,在培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元,我們分別檢測了Rho GTPase的三個主要成員Rac1、Cdc42、Rho A在NMDA處理后1h胞漿和胞核的激活水平,發(fā)現(xiàn)RhoA在胞漿的激活水平上升,而在胞核的激活水平下降；而Rac1和Cdc42的激活水平均無顯著性改變,提示srGAP3可能通過調(diào)節(jié)RhoA的激活水平從而調(diào)控神經(jīng)元存亡。于是,我們在慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)的條件下再給予NMDA處理后1h檢測了RhoA的激活水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它在胞漿的變化未受影響,而在胞核的失活被顯著逆轉(zhuǎn)。這一結(jié)果提示敲減srGAP3表達(dá)對興奮毒性NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用可能是通過逆轉(zhuǎn)胞核RhoA的失活,而NMDA導(dǎo)致的胞漿RhoA激活增加并非受到srGAP3的調(diào)控。我們已經(jīng)證實,興奮毒性發(fā)生時,srGAP3的表達(dá)水平在胞漿和胞核的變化趨勢是不同的,并且在細(xì)胞核,慢病毒shRNA敲減srGAP3可以逆轉(zhuǎn)興奮毒性NMDA刺激引起的RhoA失活。那么,srGAP3在胞漿的下游信號分子又是什么呢?Akt,又稱蛋白激酶B (PKB),是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞存活的重要信號分子。在一些神經(jīng)元的損傷死亡或疾病發(fā)生過程中,Akt已被認(rèn)為是一個可能的治療靶點,并且,它在胞漿和胞核有著不同的信號分子調(diào)控機(jī)制。于是,我們在慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)的條件下,給予培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元NMDA刺激后1h,分別檢測Akt在胞漿、胞核的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢病毒陰性對照組Akt在胞漿的磷酸化水平降低,在胞核沒有明顯變化；慢病毒shRNA組,Akt在胞漿的磷酸化水平進(jìn)一步降低,而胞核未見顯著變化。結(jié)合我們前面的結(jié)果,提示srGAP3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核分別調(diào)控不同的信號分子從而在細(xì)胞存亡中扮演不同角色,保持足夠的細(xì)胞漿srGAP3水平可能對維持Akt激活而促進(jìn)神經(jīng)元存活十分重要,興奮毒性NMDA引起的srGAP3表達(dá)降低可能通過抑制Akt激活而促進(jìn)神經(jīng)元死亡。為了獲得更有力的證據(jù),我們在活體動物進(jìn)行了實驗。用腺相關(guān)病毒攜帶shRNA敲減小鼠大腦皮層srGAP3的表達(dá),再給予NMDA刺激,觀察神經(jīng)元死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減srGAP3表達(dá)對NMDA誘導(dǎo)的小鼠大腦皮層興奮毒性損傷也有保護(hù)作用。綜上所述,我們的研究首次證實srGAP3參與神經(jīng)元興奮毒性發(fā)生過程,shRNA敲減srGAP3表達(dá)在離體培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及在體動物均對神經(jīng)元興奮毒性損傷具有保護(hù)作用。srGAP3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核分別調(diào)控不同的信號分子從而在細(xì)胞存亡中扮演不同角色,在胞漿,保持足夠的srGAP3可能對維持Akt激活而促進(jìn)神經(jīng)元存活十分重要；在胞核,敲減srGAP3表達(dá)逆轉(zhuǎn)興奮毒性NMDA誘導(dǎo)的RhoA失活而產(chǎn)生神經(jīng)元保護(hù)作用。我們的研究闡明了興奮毒性學(xué)說新的分子信號機(jī)制,為神經(jīng)保護(hù)治療提供了新的理論、實驗依據(jù)與治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：srGAP3 興奮毒性 RhoGTP酶 Akt
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-22
• 材料與方法22-38
• 1 實驗材料22-28
• 2 實驗方法28-37
• 3 統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 結(jié)果38-53
• 一、NMDA誘導(dǎo)的培養(yǎng)皮層神經(jīng)元興奮毒性過程中srGAP3全細(xì)胞蛋白水平下降38-39
• 二、慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)保護(hù)NMDA誘導(dǎo)的培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷39-42
• 三、NMDA誘導(dǎo)的培養(yǎng)皮層神經(jīng)元興奮毒性過程中srGAP3在胞漿表達(dá)水平下降,在胞核表達(dá)上升42-43
• 四、慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)逆轉(zhuǎn)NMDA誘導(dǎo)的胞核RhoA失活43-48
• 五、慢病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)NMDA誘導(dǎo)的胞漿Akt激活減少48-50
• 六、腺相關(guān)病毒shRNA敲減srGAP3表達(dá)減輕NMDA誘導(dǎo)的小鼠大腦皮層損傷50-53
• 討論53-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 成果62-63
• 綜述63-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 致謝72-74

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本文編號：665152