本文關(guān)鍵詞：大鼠大腦局灶性缺血再灌注損傷病理機制及STV保護作用的研究

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【摘要】：腦缺血再灌注損傷是一種極為復(fù)雜的病理生理過程,涉及到很多種機制,如自由基的生成、興奮性氨基酸的毒性作用、細胞內(nèi)鈣離子濃度超載等,彼此構(gòu)成一個互相促進的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。盡管對腦缺血再灌注損傷機制的研究在不斷深入和發(fā)展,但是腦缺血再灌注損傷各種機制的樞紐點/交匯點尚不明確,有待于更深入地研究。為了探究缺血/再灌注損傷早中晚期所涉及的級聯(lián)發(fā)病機制及探討STV對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其相關(guān)的保護機制。我們運用改良Longa線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。采用無創(chuàng)傷的激光多普勒血流儀實施實時的檢測,分析大鼠造模前后血流變化值,確保模型構(gòu)建的可靠性。實時監(jiān)控大鼠的心率、呼吸頻率、血氧飽和度及體溫等各項生理指標,排除手術(shù)之外的其他因素對動物模型構(gòu)建造成的影響。對各分組大鼠進行行為學(xué)評分。應(yīng)用腦切片氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,最直觀的評判腦梗死模型構(gòu)建的成功與否,同時利用Image J軟件來計算梗死面積,表觀的衡量STV對腦梗死面積的改善作用。為了探究腦組織蛋白合理有效的分離體系,我們利用不同濃度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠和4.2%-17.85%T(線性梯度),5%C(交聯(lián)度)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)為分離系統(tǒng)。利用Western blot蛋白印跡技術(shù)檢測Thioredoxin 1(Trx1)蛋白、Peroxiredoxin 2(Prx2)蛋白和Heat shock protein 60 kDa(Hsp60)蛋白分別在各組相對應(yīng)的缺血2 hours/再灌注0 hour/6 hours/22hours/168 hours時間點的表達量,探究STV是否具有神經(jīng)保護作用及其相關(guān)的可能機制。我們成功構(gòu)建了大鼠腦缺血/再灌注模型,應(yīng)用腦組織切片的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色來評估腦梗死面積,發(fā)現(xiàn)STV組跟陽性對照組大鼠的腦梗死面積比手術(shù)組減小,同時對于缺血2 hours/再灌注22 hours這個時間點的模型,STV組大鼠比陽性對照大鼠的腦梗死面積大,但是對于缺血2 hours/再灌注168 hours這個時間的模型,STV組大鼠比較陽性對照大鼠的腦梗死面積有所減小。這從一定的程度上說明了,STV對腦缺血組織具有一定的保護作用,且它的長期保護作用更為明顯,作用效果強于陽性對照藥依達拉奉。我們試驗了幾種不同濃度(10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C)的SDS-PAGE和4.2%-17.85%T(線性梯度),5%C(交聯(lián)度)SDS-PAGE,最終發(fā)現(xiàn)4.2%-17.85%T,5%C的SDS-PAGE對大鼠腦組織蛋白有較好的分離效果。免疫印跡結(jié)果表明在缺血2 hours/再灌注0 hour及6 hours時,STV給藥組Hsp60表達量減少,說明STV在腦缺血早期能減少腦組織的應(yīng)激反應(yīng)。在缺血2 hours/再灌注22 hours,STV組Prx2的表達量明顯升高和缺血2 hours/再灌注168 hours模型,Trx1的表達量明顯升高,且其表達量也高于陽性對照組。說明Prx2在腦缺血中后期發(fā)揮良好的抗氧化作用,防止自由基對腦組織的損害。Trx1在腦缺血后期發(fā)揮良好的抗氧化和抗凋亡作用,防止神經(jīng)元細胞的死亡。在缺血2 hours/再灌注22 hours時,STV組的Prx2的表達量高于同一時期Trx1的表達,說明在缺血2 hours/再灌注22 hours時,STV主要是通過上調(diào)Prx2的表達來發(fā)揮抗氧化作用。在缺血2 hours/再灌注168 hours時,STV主要是通過上調(diào)Trx1的表達來發(fā)揮抗凋亡作用。實驗結(jié)果表明,在腦缺血再灌注損傷的不同時期,STV啟動不同的信號通路來保護腦組織。除了上述的工作外,我們還進行了以下的工作。我們結(jié)合非變性微型二維凝膠電泳,網(wǎng)格凝膠切取以及定量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(獲取數(shù)據(jù)非依賴型模式,MS~E),用來構(gòu)建數(shù)字化非變性蛋白質(zhì)譜圖,同時,為了改進此研究模式,我們采用了新的質(zhì)譜串聯(lián)模式,采用了增強離子淌度分離的數(shù)據(jù)非依賴模式串聯(lián)質(zhì)譜(HDMS~E模式),并將此模式運用到人類血漿蛋白質(zhì)分析的工作中。即人類血漿樣品經(jīng)過非變性微型二維凝膠電泳分離,將得到的低密度脂蛋白(LDL)所在的長方形區(qū)域(18 mm×4.8 mm)切割成72塊方形膠粒并將膠粒經(jīng)過一系列處理后進行定量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS)。所得的結(jié)果顯示,與MS~E相比,HDMS~E表現(xiàn)出更好的分析性能,鑒定所得蛋白質(zhì)種類數(shù)目提高了約50%,并且每種蛋白質(zhì)在更多的膠粒中被檢測到,即對每種蛋白質(zhì)得到了更全面的譜圖。運用LC-HDMS~E,共檢測出253種蛋白質(zhì),根據(jù)每種蛋白質(zhì)的含量分布信息我們重構(gòu)了非變性蛋白質(zhì)譜圖。從譜圖中,我們可以看到,載脂蛋白B-100(Apo B-100)在凝膠切取區(qū)域是含量最豐富的蛋白質(zhì),主要分布區(qū)域在pI 5.1-6.1,表觀分子量在約1000 kDa,即其所在的位置在編號為39-42相對應(yīng)的四塊膠粒中。用我們編寫的Excel宏程序去檢索蛋白質(zhì)譜圖,結(jié)果表明蛋白質(zhì)的含量峰值落在Apo B-100的集中區(qū)域。在252個蛋白質(zhì)中有22個蛋白質(zhì)符合此標準,且這22個蛋白質(zhì)中有19個蛋白質(zhì)被報道跟LDL相關(guān)。這個方法僅僅需要幾微升的血漿樣品,且蛋白質(zhì)的分離原理與常用的超速離心法完全不同。這個方法所得到的結(jié)果將會使我們對LDL的結(jié)構(gòu)和功能有更深程度的理解。
【關(guān)鍵詞】：腦缺血再灌注損傷 大腦中動脈閉塞/再灌注模型 STV Heat shock protein 60 kDa(Hsp60) Peroxiredoxin 2(Prx2) Thioredoxin 1(Trx1) 非變性微型凝膠二維電泳 網(wǎng)格凝膠切取 定量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 非變性蛋白質(zhì)譜圖 低密度脂蛋白
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮略詞表14-15
• 第一章 緒論15-33
• 1.1 腦卒中現(xiàn)狀概述15
• 1.2 腦卒中病理機制及研究現(xiàn)狀15-23
• 1.3 腦卒中的藥物治療現(xiàn)狀23-25
• 1.3.1 溶栓治療23-24
• 1.3.2 降纖藥物與抗凝藥物24
• 1.3.3 抗血小板聚集藥物24
• 1.3.4 神經(jīng)保護治療24-25
• 1.4 STV及其衍生物研究背景25
• 1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法概述25-27
• 1.5.1 基于蛋白質(zhì)二維凝膠電泳分離-質(zhì)譜分析的top-down策略26
• 1.5.2 基于肽段液相色譜分離-質(zhì)譜分析的bottom-up策略26-27
• 1.6 低密度脂蛋白的概述27-29
• 1.7 本實驗研究背景、意義和內(nèi)容29-33
• 1.7.1 研究背景29-30
• 1.7.2 研究意義30-31
• 1.7.3 研究內(nèi)容31-33
• 第二章 大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注模型（MCAO/R）構(gòu)建33-56
• 2.1 引言33-35
• 2.1.1 腦卒中模型的選擇及評價33-35
• 2.1.2 大鼠大腦中動脈線栓法構(gòu)建模型的優(yōu)勢35
• 2.2 實驗儀器與材料35-39
• 2.2.1 實驗儀器35-36
• 2.2.2 實驗材料及相關(guān)溶液36-38
• 2.2.3 線栓模型制作準備38-39
• 2.3 實驗方法39-46
• 2.3.1 大鼠大腦中動脈局灶性缺血/再灌注模型的制備39-40
• 2.3.2 試驗分組和劑量、給藥40-41
• 2.3.3 模型成功性驗證41-42
• 2.3.4 生理參數(shù)檢測42-43
• 2.3.5 神經(jīng)行為學(xué)恢復(fù)的評估43-44
• 2.3.6 腦組織的切取44-46
• 2.4 結(jié)果與討論46-54
• 2.4.1 血流值測定結(jié)果46-50
• 2.4.2 生理參數(shù)測定結(jié)果50-52
• 2.4.3 腦梗死面積計算結(jié)果52-53
• 2.4.4 動物行為學(xué)評分結(jié)果53-54
• 2.5 本章小結(jié)54-56
• 第三章 不同十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)（SDS-PAGE）對腦組織蛋白的分離56-72
• 3.1 引言56-57
• 3.2 實驗材料與儀器57-58
• 3.2.1 實驗材料57
• 3.2.2 實驗儀器57-58
• 3.3 實驗方法58-63
• 3.3.1 大鼠腦蛋白質(zhì)的提取及濃度測定58-59
• 3.3.2 不同SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)的制備59-62
• 3.3.3 梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠（4.2%-17.85% T（線性梯度），，5% C（交聯(lián)度））電泳62
• 3.3.4 不同濃度（10% T，2.6% C或 12% T，2.6% C或 15% T，2.6% C）均一SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳62-63
• 3.4 結(jié)果與討論63-71
• 3.4.1 不同系統(tǒng)膠對蛋白分離的影響63-70
• 3.4.2 腦組織蛋白的特點70-71
• 3.5 本章小結(jié)71-72
• 第四章 不同時間點MCAO/R模型級聯(lián)反應(yīng)過程相關(guān)蛋白表達及量的變化72-97
• 4.1 引言72-74
• 4.2 實驗材料與儀器74-75
• 4.2.1 實驗材料74
• 4.2.2 實驗儀器74-75
• 4.2.3 相關(guān)溶液的配制75
• 4.3 實驗方法75-79
• 4.3.1 水溶性蛋白質(zhì)的提取及濃度測定75-76
• 4.3.2 大鼠腦組織蛋白質(zhì)的一維十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳76-77
• 4.3.3 大鼠腦組織蛋白質(zhì)的免疫印跡法77-79
• 4.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析79
• 4.4 結(jié)果與討論79-96
• 4.4.1 腦缺血過程中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的分析79-84
• 4.4.2 相關(guān)蛋白不同時間點表達量的變化的所涉及的級聯(lián)反應(yīng)84-89
• 4.4.3 STV與依達拉奉的比較89-96
• 4.5 本章小結(jié)96-97
• 第五章 使用數(shù)字化非變性蛋白圖譜方法分析低密度脂蛋白（LDL）及其相關(guān)蛋白97-117
• 5.1 引言97-98
• 5.2 實驗材料與儀器98-100
• 5.2.1 實驗材料98-100
• 5.2.2 實驗儀器100
• 5.3 實驗方法100-108
• 5.3.1 血漿樣品的準備100-101
• 5.3.2 人血漿蛋白的非變性二維凝膠電泳101-103
• 5.3.3 凝膠網(wǎng)格切取103-104
• 5.3.4 膠內(nèi)酶解104-105
• 5.3.5 納升級超高效液相色譜分離105-106
• 5.3.6 質(zhì)譜對肽段樣品的定性定量分析106
• 5.3.7 數(shù)據(jù)處理及蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析106-107
• 5.3.8 重構(gòu)非變性蛋白圖譜107-108
• 5.4 實驗結(jié)果與討論108-116
• 5.4.1 MS~E模式與HDMS~E模式的比較108
• 5.4.2 Apo B-100 的分布及網(wǎng)格切取區(qū)域其他主要的血漿蛋白108-111
• 5.4.3 運用數(shù)字化蛋白質(zhì)譜圖進行低密度脂蛋白相關(guān)蛋白搜索111-113
• 5.4.4 已報道的LDL相關(guān)蛋白結(jié)果的比較113-114
• 5.4.5 數(shù)字化天然蛋白圖譜在分析LDL結(jié)合蛋白的特征114-116
• 5.5 本章小結(jié)116-117
• 結(jié)論與展望117-121
• 結(jié)論117-118
• 創(chuàng)新點118-119
• 展望119-121
• 參考文獻121-132
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果132-133
• 致謝133-134
• 附件134

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：652586