本文關(guān)鍵詞：表達(dá)NR1的293T細(xì)胞構(gòu)建及其在抗NMDA受體自身抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

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【摘要】：抗NMDA受體腦炎(anti-NMDA receptor encephalitis)具有類似于邊緣葉腦炎癥狀特點(diǎn),如認(rèn)知障礙、精神行為異常、癲癇發(fā)作、意識(shí)障礙等,其中精神行為異常較邊緣葉腦炎更重,同時(shí)認(rèn)知障礙更加典型和突出,并可有累及腦干產(chǎn)生的中樞性通氣不足、意識(shí)不清等癥狀。NMDA受體廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng),在端腦、胼胝體回、海馬、丘腦、紋狀體、小腦、腦干、脊髓、腸道神經(jīng)等均有大量分布,其他部位也有存在。目前抗NMDA受體腦炎診斷主要依據(jù)是抗NMDA受體NR1亞基IgG抗體(+)。NR1亞基IgG抗體在抗NMDA受體腦炎患者腦脊液中陽性率為100%�？筃MDA受體抗體檢測(cè)對(duì)抗NMDA腦炎的診斷具有非常高的敏感性和特異性。目前實(shí)驗(yàn)室檢查金標(biāo)準(zhǔn)為間接免疫熒光法,目前生產(chǎn)該檢測(cè)試劑盒的均是歐洲和美國(guó)廠家,其中在國(guó)內(nèi)被大量使用并被臨床驗(yàn)證過的檢測(cè)試劑盒是歐蒙公司生產(chǎn)的抗體檢測(cè)試劑盒。價(jià)格昂貴。如果檢測(cè)患者抗體滴度,以及同時(shí)檢測(cè)血清、腦脊液標(biāo)本,則單次檢查費(fèi)用要提高數(shù)倍。研究目的:通過構(gòu)建過表達(dá)NMDA受體NR1亞基的293T細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)一種成本較低的檢測(cè)抗NMDA受體自身抗體的檢測(cè)方法,并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)初步進(jìn)行抗NMDA受體腦炎患者抗體檢測(cè)并與商品化試劑盒進(jìn)行比較驗(yàn)證檢測(cè)效率。研究方法:1、對(duì)攜帶GRIN1基因的載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得GRIN1全長(zhǎng)編碼序列,然后通過酶切、連接將該序列接入FUGW質(zhì)粒載體,獲得FUGW-GRIN1-IRES-EGFP質(zhì)粒。2、將連接后載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,收集并鑒定質(zhì)粒。3、通過四質(zhì)粒系統(tǒng)將FUGW-GRIN1-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒包裝。4、待293T細(xì)胞內(nèi)病毒包裝、釋放完畢,收集含病毒載體的細(xì)胞培養(yǎng)液,通過離心收集病毒。5、用攜帶GRIN1基因的慢病毒載體感染目標(biāo)細(xì)胞293T細(xì)胞并驗(yàn)證GRIN1基因表達(dá)。6、以實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)檢測(cè)抗NMDA受體抗體陽性以及陰性的病人腦脊液樣本孵育表達(dá)GRIN1的293T細(xì)胞,并進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),分析樣本中的抗體情況并與商品化試劑盒進(jìn)行比對(duì)。研究結(jié)果:1、成功構(gòu)建慢病毒載體FUGW-GRIN1-IRES-EGFP。2、成功包裝攜帶GRIN1基因的慢病毒顆粒。3、成功構(gòu)建過表達(dá)GRIN1基因的293T細(xì)胞。4、過表達(dá)293T細(xì)胞對(duì)抗NMDA受體抗體的檢測(cè)陽性率,與商品化試劑盒的一致率為95%。結(jié)論:1.選擇與國(guó)外產(chǎn)品不同的構(gòu)建方法,優(yōu)選慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)GRIN1基因的細(xì)胞株,我們成功的將慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞并高效表達(dá)NMDA受體NR1亞基蛋白。2.對(duì)于腦脊液內(nèi)抗體滴度的估測(cè),我們與國(guó)外檢測(cè)試劑盒的估測(cè)結(jié)果相符。與國(guó)外試劑盒相比,我們采用雙熒光標(biāo)記,檢測(cè)前觀察綠色熒光表達(dá)情況即可判斷目的基因的表達(dá)情況,過程簡(jiǎn)單,并且能夠減少因構(gòu)建細(xì)胞不表達(dá)或少量表達(dá)GRIN1基因而產(chǎn)生的假陰性結(jié)果,同時(shí)在抗體滴度的計(jì)算上更具有優(yōu)勢(shì)。4.根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該項(xiàng)技術(shù)具有應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：抗NMDA受體腦炎 NMDA受體 慢病毒載體 293T細(xì)胞 自身抗體檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮略語詞表9-10
• 前言10-12
• 第一部分 表達(dá)GRIN1基因慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定12-37
• 一、實(shí)驗(yàn)材料12-17
• 二、主要實(shí)驗(yàn)步驟17-29
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-35
• 四、討論35-37
• 第二部分 應(yīng)用表達(dá)NR1的 293T細(xì)胞爬片檢測(cè)抗NMDA受體抗體腦炎患者腦脊液37-43
• 一、試驗(yàn)材料37-38
• 二、主要實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 三、結(jié)果40-41
• 四、討論41-43
• 存在問題與展望43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 綜述46-59
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明59-60
• 致謝60

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本文編號(hào)：609124