本文關鍵詞：靶向RWDD3基因shRNA慢病毒載體的構建及功能鑒定

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【摘要】：目的構建RWD結構小泛素化增強子(RWDD3)shRNA慢病毒表達載體,為探討RNA干擾技術抑制人腦膠質瘤細胞RWDD3基因的相關研究奠定基礎。方法設計RWDD3的3條siRNA的靶點序列,合成含干擾序列的雙鏈DNA發(fā)卡結構shRNA,分別與雙酶切后的載體連接,構建3種重組質粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并轉化于DH5α感受態(tài)細胞,提取陽性克隆質粒測序,轉染293T細胞,生產慢病毒顆粒,并檢測病毒滴度。將3種重組慢病毒及陰性對照病毒分別感染人腦膠質瘤細胞U251,實時定量PCR和Western blot分別檢測RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。結果測序結果證實3種慢病毒載體均包裝成功,滴度分別為5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表達量均較陰性對照組和未感染組明顯降低(P0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用顯著,mRNA表達下調79.2%,蛋白表達下調68.2%(P0.05);而陰性感染對照組和未感染組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論成功構建3種RWDD3shRNA慢病毒表達,可有效下調U251細胞RWDD3mRNA和蛋白的表達,其為進一步研究以RWDD3為靶點的腦膠質瘤基因治療提供穩(wěn)定轉染細胞的載體奠定基礎。
【作者單位】： 南昌大學第二附屬醫(yī)院神經外科;
【關鍵詞】： 腦膠質瘤 RWDD 慢病毒 shRNA
【基金】：江西省自然科學基金計劃項目(No.20132BAB205043) 江西省教育廳科學技術研究項目(No.GJJ14066)~~
【分類號】：R739.41;R3416
【正文快照】： 腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,系統(tǒng)Lentivector　Packaging　Kit購自上海吉凱基因具有無控性增殖、侵襲性生長、易復發(fā)、預后極差的特化學公司;限制性內切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和連接試劑點[1-2]。其本質上是一種多基因異常疾病,由于原癌盒購自NEB公司;質粒提取試劑盒

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