本文關(guān)鍵詞：N-乙酰半胱氨酸可恢復(fù)TDP-25所致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞持續(xù)性鈉通道功能異常

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【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種選擇性損害上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病。本病具有慢性、進(jìn)行性、致死性的特點(diǎn)。本病的大部分患者是散發(fā)型,約10%患者存在家族性常染色體顯性遺傳史,即為家族型,20%的家族型患者存在銅/鋅超氧化物岐化酶(SOD1)基因突變。目前研究發(fā)現(xiàn),約3%的家族型患者以及2.9%散發(fā)型患者存在TAR-DNA結(jié)合蛋白43(TDP-43)基因突變,表明ALS的發(fā)病與TDP-43基因突變有著密切的關(guān)系。TDP-43蛋白是一種由定位于chrlp36.2的TARDBP基因編碼的核蛋白,具有結(jié)合單鏈DNA、RNA的功能,同時(shí)參與m RNA的轉(zhuǎn)錄并維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。許多研究表明,在FTLD-TDP或者ALS患者發(fā)現(xiàn)的TDP-43蛋白通常表現(xiàn)為高度磷酸化、泛素化、易裂解、移位到細(xì)胞質(zhì)并聚集。這些特征使TDP-43喪失了正常功能,相反具有毒性作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突變短,髓鞘的脫失。目前發(fā)現(xiàn)突變的TDP-43會(huì)引起線粒體功能障礙、氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)TDP-25蛋白的分子量為25k Da,是TDP-43的C末端被酶分解的片段之一。TDP-25可以促進(jìn)TDP-43包涵體的形成,對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有更強(qiáng)的毒性作用。TDP-25引起線粒體功能紊亂以及加速氧化損傷,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性,在ALS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TDP-43可引起細(xì)胞的高興奮性,興奮性增高的神經(jīng)元會(huì)導(dǎo)致異常動(dòng)作電位的爆發(fā),引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,產(chǎn)生興奮性毒性。目前研究發(fā)現(xiàn)TDP-43的表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞線粒體功能障礙,能量不足,加重氧化損傷。主要表現(xiàn)為活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增多,細(xì)胞不能維持正常的清除作用。大量的活性氧聚集使得線粒體膜電位異常以及呼吸鏈損傷,引起能量依賴性離子通道功能改變,同時(shí)使得細(xì)胞內(nèi)高鉀和細(xì)胞外高鈉的離子濃度發(fā)生改變。目前研究還發(fā)現(xiàn)ALS患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元鈉離子內(nèi)向電流的增加,其機(jī)制主要與持續(xù)性鈉通道的表達(dá)上調(diào)和(或)該通道功能異常相關(guān),而內(nèi)向鈉離子電流增大直接導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元較易爆發(fā)動(dòng)作電位從而增加了能量的消耗和自由基的產(chǎn)生。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種分子量較小的半胱氨酸的衍生物。由于其小的分子量以及分子結(jié)構(gòu)決定了易通過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞后脫乙酰基成為谷胱甘肽的合成的必須氨基酸,又稱為還原型谷胱甘肽的前體。NAC的主要功能一方面是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢(shì)穩(wěn)定,另一方面還可以透過細(xì)胞膜及線粒體膜通過分子內(nèi)結(jié)構(gòu)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS,成為一種有效的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用不同濃度NAC作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞后記錄持續(xù)性鈉電流,進(jìn)一步分析NAC對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細(xì)胞的作用以及TDP-25在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。目的:本實(shí)驗(yàn)研究目的是分別檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25和空質(zhì)粒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的持續(xù)性鈉電流,并比較電流是否存在差別;分析不同濃度N-乙酰半胱氨酸對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用。進(jìn)一步探究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的興奮性增高與氧化損傷在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25和Empty(空質(zhì)粒)兩種細(xì)胞,該NSC34細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,應(yīng)用規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng),首先通過篩選單克隆細(xì)胞,然后免疫組化鑒定TDP-25蛋白的表達(dá)程度,選擇TDP-25蛋白表達(dá)95%以上的細(xì)胞。將這些篩選后的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細(xì)胞以及空質(zhì)粒細(xì)胞。在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)下,記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細(xì)胞、空質(zhì)粒細(xì)胞的持續(xù)性鈉電流;將終濃度分別為20umol/LNAC、50umol/LNAC、80umol/LNAC作用于TDP-25細(xì)胞24小時(shí)后,分別記錄3組不同濃度下細(xì)胞的持續(xù)性鈉電流的水平。統(tǒng)計(jì)持續(xù)性鈉電流的差異性。結(jié)果:TDP-25組與Empty組的持續(xù)性鈉電流相比,TDP-25組的電流幅度以及電流密度增大(P=0.03,P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。給予藥物濃度分別為20umol/L,50 umol/L,80 umol/L的NAC作用于TDP-25組細(xì)胞24小時(shí)后的持續(xù)性鈉電流相比較,50umol/LNAC組的持續(xù)性鈉電流幅度減少明顯(P=0.04,P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);20umol/L組電流幅度減小,與TDP-25組比較變化不明顯(P0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);80 umol/L濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)無明顯變化(P0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。五組間I-V曲線進(jìn)行比較分析得出持續(xù)性鈉電流均存在電壓依賴性,曲線呈現(xiàn)一個(gè)V字形,Empty組、50μmol/L NAC組I-V曲線較TDP-25組上移。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:TDP-25組:n=25電流幅度:-74.69±17.64p A;電流密度:-3.18±1.723 p A/pf Empty組:n=20電流密度:-30.60±6.72p A;電流密度:0.52±0.024p A/pf藥物作用TDP-25結(jié)果如下:20μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-62.62±11.63p A;電流密度:0.52±0.024p A/pf50μmol/L NAC組::n=10電流幅度:-34.56±10.07p A;電流密度:-1.73±0.42 p A/pf80μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-66.30±18.23p A;電流密度:-3.06±0.955 p A/pf結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中,我們得出穩(wěn)定表達(dá)TDP-25的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞與對(duì)照組比較持續(xù)性鈉電流明顯增大,提示細(xì)胞興奮性水平增高,在ALS的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。N-乙酰半胱氨酸具有抑制氧化應(yīng)激減少氧化產(chǎn)物作用,50μmol/L NAC降低持續(xù)性鈉電流幅度,應(yīng)用20μmol/L和80μmol/L的NAC不能恢復(fù)TDP-25誘導(dǎo)的持續(xù)性鈉通道功能,提示過少或過多氧自由基的清除,均不能對(duì)TDP-25所致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性起到保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化 持續(xù)性鈉通道 TDP-25 氧化應(yīng)激 N-乙酰半胱氨酸 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R744.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-19
• 結(jié)果19-23
• 附圖23-29
• 討論29-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-37
• 綜述 持續(xù)性鈉電流的相關(guān)研究37-50
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷51

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本文編號(hào)：546953