本文關鍵詞：白藜蘆醇對魚藤酮致神經(jīng)元氧化損傷的保護作用及分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常見于中老年人的運動障礙性疾病,也是僅次于阿爾茨海癥的第二大慢性神經(jīng)退行性疾病,該病的主要病理學特點是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失,并形成以a-突觸核蛋白、泛素、神經(jīng)絲蛋白為主的Lewy、體。據(jù)統(tǒng)計,65歲以上人群中PD的發(fā)病率高達1.7%。隨著我國人口老齡化的加劇,PD的患病率逐年增加,嚴重威脅著中老年人的身心健康。因此,闡明PD的發(fā)病機制是迫切需要解決的問題。諸多的研究已證實家族性PD與遺傳因素有關,但90%的散發(fā)性PD的病因不清,尤其是黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的特異性退變至今未能完全解釋。早在上世紀90年代,因吸食含有N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的海洛因,吸食者出現(xiàn)典型的PD癥狀,并且外源性MPTP可在靈長類動物中復制出PD的動物模型。由此,環(huán)境因素逐漸成為PD研究關注的焦點。流行病學調(diào)查顯示,長期接觸殺蟲劑和除草劑顯著增加PD的患病風險。魚藤酮是從植物毛魚藤中提取而來的廣泛應用于農(nóng)業(yè)中的殺蟲劑,與1-甲基-4苯基吡啶離子(MPP+)結(jié)構(gòu)類似,均有聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),魚藤酮可抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性,降低ATP合成,并誘導神經(jīng)細胞線粒體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)積聚,進而導致線粒體氧化損傷,最終觸發(fā)細胞凋亡。給予魚藤酮處理的小鼠,不僅誘發(fā)類似PD的癥狀表現(xiàn),還選擇性導致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目減少。臨床研究也證實,PD患者脂質(zhì)過氧化物、DNA氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷顯著升高。同時,機體氧自由基清除系統(tǒng)谷胱甘肽減少,過氧化氫酶活性下降,提示氧化應激介導了PD神經(jīng)元凋亡。盡管上述研究表明魚藤酮參與了PD的氧化應激,但具體魚藤酮導致神經(jīng)氧化損傷的分子機制還需要進一步的闡明。白藜蘆醇是一種存在于葡萄、花生紅衣中的多酚類天然化合物,是植物抵御外界侵襲的抗毒素。近年來,因其廣泛的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及神經(jīng)保護等作用,尤其是其抗氧化應激的突出功效日益受到人們的關注。已有學者研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可改善PD模型鼠的行為學改變,并增加紋狀體組織抗氧化酶活性。白藜蘆醇是沉默信號調(diào)控因子1(silence signal regulation fator1, SIRT1)最強的激活劑。SIRT1也是最先發(fā)現(xiàn)Sirtuin家族成員。通過去乙�；饔�,SIRT1可調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)修飾,從而參與細胞代謝、衰老及發(fā)育等一系列生理及病理過程。以往的研究報道,SIRT1可減少氧化應激而保護血管功能,并能升高過氧化氫酶活性。過表達SIRT1顯著提高神經(jīng)元對氧自由基毒性損傷的耐受力。作為SIRT1的下游分子靶點,絲／蘇氨酸蛋白激酶Akt1可被SIRT1去乙酰化激活為p-Akt1,與氧化應激、細胞凋亡及蛋白合成等密切相關,已有學者研究發(fā)現(xiàn)PD患者p-Akt1的活性降低。但SIRT1/Akt1信號通路是否介導了白藜蘆醇拮抗魚藤酮誘導的神經(jīng)氧化損傷作用尚不清楚。基于上述背景,我們設計了本課題,旨在深入探討魚藤酮誘導PC12細胞損傷的分子機制,觀察白藜蘆醇對魚藤酮誘導的細胞損傷是否具有保護作用,并分析SIRT1和Akt1在白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護中的作用。首先,我們建立了魚藤酮損傷的細胞模型。給予不同濃度的魚藤酮損傷PC12細胞后觀察形態(tài)變化,通過CCK8、LDH檢測分析細胞活性變化,發(fā)現(xiàn)暴露在不同濃度的魚藤酮中,細胞會出現(xiàn)不同程度的損傷,細胞活性下降,且呈劑量依賴性。其次,在魚藤酮毀損PC12細胞24小時之前給予不同濃度的白藜蘆醇進行預保護,檢測細胞形態(tài)和細胞活性變化,結(jié)果顯示,白藜蘆醇可抑制魚藤酮誘導的細胞損傷。經(jīng)不同濃度的白藜蘆醇預保護PC12細胞2小時之后,細胞形態(tài)發(fā)生了不同變化,隨著濃度的升高細胞活性增強, 其中以251μM白藜蘆醇保護效果最明顯,較損傷組軸突變長,胞體變圓,細胞活性升高,而100μM的高濃度白藜蘆醇沒有保護效果,且加重了細胞損傷。然后,我們應用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽DCFH-DA檢測、JC-1染色和Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)雙染技術分別檢測細胞內(nèi)活性氧ROS水平、線粒體膜電位的變化和細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇抑制魚藤酮誘導的氧化損傷、并增強線粒體功能及抑制細胞凋亡。和魚藤酮損傷組比較,給予25μM的白藜蘆醇2小時預保護后,細胞凋亡率和死亡率明顯下降,細胞內(nèi)生成ROS減少,以及線粒體膜電位升高。為進一步探討其中的分子機制接下來采用Real-timePCR和Western Blotting檢測了PC12細胞內(nèi)SIRT1和Akt1的mRNA表達量以及蛋白表達量。發(fā)現(xiàn)和對照組比較,在魚藤酮損傷組檢測到SIRT1和Akt1的mRNA的表達量下降,SIRT1、p-Aktl的蛋白表達量下降,25μM白藜蘆醇預保護PC12細胞能夠部分逆轉(zhuǎn)這種下降。最后,在白藜蘆醇保護組中給予SDRT1的特異性抑制劑尼克酰胺,Akt1的抑制劑LY294002和MK-2206分別阻斷SIRT1/Aktl的表達,以進一步明確SIRT1/Aktl信號通路是否參與了白藜蘆醇的對抗魚藤酮損傷PC12細胞的作用。應用SIRT1的特異性抑制劑,尼克酰胺抑制其生物活性,結(jié)果顯示PC12細胞活性下降,白藜蘆醇保護PC12的作用下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表達均降低；然后給予Akt1的特異性抑制劑LY294002,抑制Akt1活性,同樣CCK8顯示細胞活性下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表達降低。并且用Akt1的另一新型特異性抑制劑MK-2206結(jié)果同LY294402一致。分別加入阻斷劑之后,尼克酰胺降低了SIRT1在蛋白和mRNA水平的表達,而LY294002和MK-2206作為Akt1的阻斷劑不僅阻斷了Akt1的激活也降低了SIRT1的表達,這表明SIRT1和Akt1之間可能存在著相互調(diào)節(jié)的關系。綜上所述,本項研究結(jié)果表明,魚藤酮可誘導神經(jīng)元ROS產(chǎn)生、線粒體功能損傷,進而導致神經(jīng)細胞凋亡；白藜蘆醇可通過抗氧化應激拮抗魚藤酮導致的神經(jīng)元毒性損傷,其機制可能是通過增強SIRT1/Aktl分子通路的表達起到神經(jīng)保護作用。
【關鍵詞】：魚藤酮 白藜蘆醇 線粒體 SIRT1 Akt1
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號說明12-13
• 前言13-16
• 實驗材料16-20
• 實驗方法20-28
• 結(jié)果28-33
• 討論33-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖表39-50
• 參考文獻50-54
• 致謝54-55
• 碩士期間發(fā)表論文情況55-56
• 附件56

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