本文關(guān)鍵詞：小鼠脊髓神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)、分化及其影響因素研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致的疾病,隨著時間的推移而加重,最終導(dǎo)致功能障礙。因其發(fā)病機理復(fù)雜,其病理機制至今尚未闡明,臨床治療尚無肯定而有效的措施。神經(jīng)干／祖細胞治療為這類疾病治療帶來了希望,但在干細胞臨床應(yīng)用之前,需要我們清楚干細胞增殖和分化的調(diào)控機制及干細胞定向分化策略,從而使之向指定的方向分化。調(diào)控干細胞增殖信號通路中,Rho/Rho(Ras homologue)激酶信號傳導(dǎo)通路是焦點之一。本實驗選擇Rho激酶抑制劑Y-27632將其運用于小鼠脊髓神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和分化之中,研究Rho激酶抑制劑Y-27632對于小鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞增殖及分化的影響。[方法]選擇13-15天的C57胚胎期小鼠,分離獲得脊髓組織,使用胰酶消化并懸浮培養(yǎng)后獲得神經(jīng)干細胞,用免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細胞,將所獲得的神經(jīng)干細胞分為實驗組與對照組,在實驗組中加入Y-27632 (10μoml/L),研究Y-27632對神經(jīng)千細胞增殖、分化的作用。在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)體系中,持續(xù)5-7代加入Y-27632,通過免疫熒光染色法、定量RT-PCR及Western-Blot蛋白水平檢測法等,檢測神經(jīng)干細胞干性標(biāo)記、分化細胞標(biāo)記以及BrdU與Nestin雙陽性的細胞。在神經(jīng)干細胞含0.5%FBS的分化培養(yǎng)體系中加入Y-27632,用免疫熒光染色法、western blo、 RT-PCR檢測神經(jīng)干細胞及其各分化細胞的情況,分析Y-27632對神經(jīng)干細胞分化的影響。[結(jié)果]從13-15天胚胎期小鼠脊髓中分離培養(yǎng)獲得神經(jīng)干細胞,神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)記Nestin(巢蛋白)陽性細胞純度高于90%。通過免疫熒光染色法、Western Blot和RT-PCR等方法,從細胞數(shù)量、蛋白表達水平和RNA水平比較發(fā)現(xiàn)：對懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞,Y-27632抑制其增殖能力而促進其分化。為進一步驗證Y-27632促進分化的作用,在神經(jīng)干細胞自發(fā)分化體系中加入Y-27632。Y-27632促進神經(jīng)干細胞分化為GFAP陽性細胞。[結(jié)論]Y-27632 (10μoml/L)對小鼠脊髓神經(jīng)干細胞的增殖無促進作用；Y-27632有促進小鼠脊髓神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化的作用。[目的]長期以來人們認為哺乳動物成體神經(jīng)細胞及神經(jīng)通路出生后就固定不變的,中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦及脊髓受損將導(dǎo)致永久性的功能損失。然而,1992年Reynolds成功從成年小鼠紋狀體中培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞及1996年脊髓神經(jīng)干細胞的成功培養(yǎng),說明出生以后神經(jīng)再生還持續(xù)存在,干細胞治療為神經(jīng)退行性疾病治愈提供了可能。人們對神經(jīng)干細胞的研究經(jīng)歷了從胚胎干細胞、胚胎時期培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細胞到從成體動物神經(jīng)組織內(nèi)直接獲得神經(jīng)干細胞的研究過程。對前二者的研究,由于不可避免的移植排斥反應(yīng),應(yīng)用時需大劑量的免疫抑制劑。而從成體動物體內(nèi)獲得神經(jīng)干細胞則沒有此方面的問題。但脊髓神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)較腦源性神經(jīng)干細胞培養(yǎng)困難。成體脊髓長度較長,含有大量的神經(jīng)纖維及髓鞘,本實驗將研究成體脊髓各節(jié)段的神經(jīng)干細胞情況,系統(tǒng)比較各節(jié)段神經(jīng)干細胞的差異,尋找能更有效的培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞的方法。[方法]選擇8-12周的C57成年小鼠,分離獲得脊髓組織,按照頸、胸、腰、骶尾分為四段,經(jīng)酶消化并培養(yǎng)后獲得神經(jīng)干細胞,用免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細胞,并進行計數(shù)比較；分別進行傳代后,比較倍增數(shù)。各節(jié)段的神經(jīng)干細胞予以含0.5%FBS的分化培養(yǎng)基自然分化7天后,用免疫熒光染色法觀察形態(tài)。將小鼠的脊髓組織各節(jié)段分別進行提取蛋白及RNA,通過Western Blot、 RT-PCR檢測比較其神經(jīng)干細胞含量。對脊髓各節(jié)段經(jīng)冰凍切片后,行免疫熒光染色后,比較神經(jīng)干細胞的數(shù)量情況。[結(jié)果]從8-12周的C57成年小鼠中,分離脊髓組織經(jīng)酶消化培養(yǎng),成功獲得神經(jīng)干細胞,經(jīng)免疫熒光染色法鑒定帶有神經(jīng)干細胞特異標(biāo)記物Nestin和Sox2的細胞,計數(shù)后比較培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞數(shù)量：胸段頸段腰段骶尾段。從細胞傳代倍增數(shù)上比較：胸段頸段腰段骶尾段。對脊髓組織不同節(jié)段在蛋白及RNA水平比較神經(jīng)干細胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。脊髓組織進行切片染色后細胞計數(shù)神經(jīng)干細胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。[結(jié)論]成年C57小鼠脊髓各節(jié)段干細胞含量：頸段胸段腰段骶尾段。從細胞培養(yǎng)的有效性上,骶尾段含有的神經(jīng)纖維及髓鞘較頸、胸、腰段的少,神經(jīng)干細胞含量最多,體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞也最多。
【關(guān)鍵詞】：脊髓神經(jīng)干細胞 Y-27632 增殖 分化 GFAP 脊髓神經(jīng)干細胞 成體 Nestin 脊髓節(jié)段
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)5-7
• 第一部分：小鼠胎鼠脊髓神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)、分化及Y-27632對其增殖、分化的影響作用7-48
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-32
• 結(jié)果32-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-48
• 第二部分：小鼠成體脊髓神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)、分化及各節(jié)段間神經(jīng)干細胞數(shù)量比較48-77
• 中文摘要48-50
• 英文摘要50-52
• 前言52-53
• 材料與方法53-66
• 結(jié)果66-74
• 討論74-75
• 結(jié)論75-76
• 參考文獻76-77
• 綜述77-86
• 參考文獻82-86
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果86-87
• 致謝87

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本文編號：482924