本文關(guān)鍵詞：番茄紅素對轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A的NSC34細胞的保護作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:肌萎縮側(cè)索硬化癥為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種,其特征是選擇性的侵犯脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體細胞及錐體束,導致上、下運動神經(jīng)元變性死亡�；颊叱霈F(xiàn)上下運動神經(jīng)元同時損害的臨床特征,以單側(cè)或雙側(cè)手指活動笨拙無力為常見首發(fā)癥狀。本病晚期出現(xiàn)延髓麻痹,在患者意識始終清醒的情況下,出現(xiàn)舌肌萎縮、構(gòu)音不清、飲水嗆咳、吞咽困難等癥狀,嚴重影響患者生存質(zhì)量,給患者帶來巨大痛苦。隨著疾病病程的持續(xù)進展,在發(fā)病之后3~7年內(nèi)多因呼吸肌受累死于肺部感染或呼吸肌麻痹所致的呼吸衰竭。目前國際范圍內(nèi)對ALS發(fā)病機制的相關(guān)研究主要關(guān)注于其相關(guān)突變蛋白h SOD1-G93A,因此,針對此突變蛋白所造成的損傷進行治療方面的研究就具有重要意義。番茄紅素是一種含有碳碳共軛雙鍵的類胡蘿卜素,因其結(jié)構(gòu)中大量的C=C-C=C存在使得其具有抗氧化能力�，F(xiàn)有研究證實,番茄紅素能夠通過Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導通路,上調(diào)Ⅱ相解毒酶的表達,從而保護細胞,對抗氧化損傷。目前研究發(fā)現(xiàn),在SOD1突變模型中,至少有14種受Nrf2調(diào)控的基因表達出現(xiàn)下調(diào),包括NQO1、GST、HO-1、細胞色素P450、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等。但是目前國內(nèi)外均缺乏將番茄紅素應用于治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的體外實驗證據(jù)。本實驗采用突變的h SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSC34細胞,從抗氧化應激角度探討番茄紅素對轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A的NSC34細胞的影響及其可能機制,為將來尋求治療肌萎縮側(cè)索硬化癥廣泛普及的藥物打下初步的研究基礎(chǔ)。方法:1實驗分組實驗設(shè)置空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組以及不同濃度的番茄紅素處理組(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)。以DMSO溶解番茄紅素,于轉(zhuǎn)染操作后24小時向各組細胞加入DMSO或不同劑量的番茄紅素(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時,用于后續(xù)實驗。2細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染取凍存于液氮罐中的NSC34細胞,予以復蘇。培養(yǎng)液使用含有10%滅活的胎牛血清及青鏈霉素的高糖DMEM,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。于細胞復蘇傳代3次以后,待細胞突起明顯、形態(tài)良好、匯合度為80%~90%時,于細胞對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A質(zhì)粒、空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染操作過程依照LipofectamineTM 2000試劑說明書進行規(guī)范操作。轉(zhuǎn)染操作后24小時給予番茄紅素處理,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。即轉(zhuǎn)染后48小時收集標本,用于后續(xù)實驗。3細胞丙二醛(MDA)含量檢測收集轉(zhuǎn)染后48小時的各組細胞,使用硫代巴比妥酸(TBA)法測定細胞MDA水平。操作過程依照試劑說明書進行規(guī)范操作,于532nm處,讀取吸光度值。4目的蛋白表達水平檢測——蛋白免疫印跡(Western Blot)提取細胞總蛋白,以Bicinchoninic acid(BCA)法測定細胞總蛋白濃度。以60μg為蛋白上樣量,進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。之后,將凝膠中的蛋白電泳轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜與一抗于4℃搖床孵育至少12小時。再將PVDF膜與結(jié)合有熒光染料的二抗于室溫下避光孵育1小時。之后使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描,結(jié)合Image J軟件進一步確定目的蛋白表達水平。5細胞凋亡率測定消化各組NSC34細胞,制備成單細胞懸液,500rpm,5分鐘條件下離心,棄上清,將細胞以預冷的PBS重懸并計數(shù)。取1-5*105個細胞再次以上述條件離心,棄上清,加入500μl 1x Binding buffer重懸,再加入5μl PI,室溫避光孵育30分鐘,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果:1成功培養(yǎng)NSC34細胞,完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于倒置熒光顯微鏡下觀察證實,NSC34細胞貼壁良好,形態(tài)規(guī)則,突起明顯,成功培養(yǎng)NSC34細胞。于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組和番茄紅素處理組的細胞,證實均存在EGFP綠色熒光;對于轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組和番茄紅素處理組細胞,蛋白質(zhì)免疫印跡法在相應位置檢測到含EGFP標簽的外源性SOD1(Fig.5),流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率為23.30%和26.21%,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成。2丙二醛(MDA)含量測定MDA含量代表了細胞脂質(zhì)過氧化水平,可間接反映氧化應激水平。收集轉(zhuǎn)染48小時后細胞,測定MDA,結(jié)果顯示,空白對照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細胞MDA含量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組細胞MDA含量明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P0.05),達2.25nmol/mgprot。各個番茄紅素處理組(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)的MDA含量均不同程度的高于轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組,分別為1.94 nmol/mgprot、1.46 nmol/mgprot、1.30 nmol/mgprot,呈劑量相關(guān)性,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。證實轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A能夠引起NSC34細胞脂質(zhì)過氧化損傷,番茄紅素能夠減輕這種損傷,減輕程度與給藥濃度呈劑量相關(guān)性。3 NQO-1表達水平測定NQO-1是涉及對抗活性氧損傷的一種關(guān)鍵酶,在氧化應激條件下NQO-1的表達被誘導,為細胞提供多重保護。NSC34細胞轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A后24小時給予番茄紅素(7.5μmol/L)、48小時收集細胞并提取細胞蛋白用于蛋白質(zhì)免疫印跡,觀測NQO-1蛋白表達水平的變化。結(jié)果顯示,相比于空白對照組,轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組NQO-1蛋白表達水平明顯下降,為29.85%,番茄紅素處理組(7.5μmol/L)NQO-1蛋白表達水平為67.01%,明顯高于轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4細胞凋亡率凋亡中、晚期細胞以及死亡細胞,細胞膜的完整性受到比較嚴重的破壞,碘化丙啶(PI)可進入細胞內(nèi)將細胞核紅染,可用來較為客觀地判定細胞凋亡率。轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A 24小時后給予番茄紅素處理(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L),48小時后收集細胞用于凋亡率檢測。結(jié)果顯示相比于轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A組40.08%的凋亡率,各番茄紅素處理組(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)細胞凋亡率均降低,分別為36.55%、30.15%、24.8%,且降低程度與番茄紅素給藥濃度呈劑量相關(guān)性,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:番茄紅素對轉(zhuǎn)染h SOD1-G93A的NSC34細胞有保護作用,主要表現(xiàn)為:1減輕細胞脂質(zhì)過氧化,且減輕程度與番茄紅素濃度呈劑量相關(guān)性。2上調(diào)了NQO-1蛋白表達水平。3降低細胞凋亡率。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化 超氧化物歧化酶 氧化應激 NQO-1 番茄紅素
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R744.8
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文縮寫12-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-25
• 結(jié)果25-27
• 附圖27-31
• 討論31-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻33-36
• 綜述 Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導通路與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病36-48
• 參考文獻42-48
• 致謝48-49
• 個人簡歷49

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本文編號：431168