發(fā)布時間：2017-06-06 17:12

  本文關(guān)鍵詞：膠質(zhì)母細胞瘤替莫唑胺耐藥機制的亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)是成人顱內(nèi)最常見的、惡性程度最高的原發(fā)惡性腫瘤,即使采用了在最大安全范圍手術(shù)切除腫瘤的基礎(chǔ)上輔以同步放化療,仍然復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。雖然大樣本臨床數(shù)據(jù)已經(jīng)證實在安全范圍內(nèi)手術(shù)切除腫瘤后在輔助放療時加入替莫唑胺(temozolomide, TMZ)同步放化療,GBM患者中位生存期及2年存活率較單純放療明顯提高,但患者的中位生存期仍僅約14.6月,而腫瘤細胞對TMZ的抵抗是患者預(yù)后差的主要原因之一。盡管目前投入了大量關(guān)于GBM對TMZ耐藥的研究,但TMZ具體的耐藥機制仍未闡述清楚。目前對TMZ耐藥機制以單個蛋白的研究為主,盡管也有大量的蛋白組學(xué)研究來闡述TMZ耐藥機制,但仍未明確。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是在大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化的水平上研究蛋白質(zhì)的特征,它包括了蛋白的表達水平,蛋白翻譯后的修飾,蛋白與蛋白之間的相互作用等,從而得到對蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生,細胞代謝等過程的整體而全面的了解。當(dāng)然,這里的蛋白質(zhì)是指一個細胞或組織中由基因組表達的全部蛋白質(zhì)。然而,全部蛋白質(zhì)的組成是極其復(fù)雜的,直接對其進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,往往會丟掉很多蛋白信息。同時,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)全蛋白質(zhì)組是處于動態(tài)變化的,存在時間上的特殊性和空間上的多樣性,在不同的環(huán)境影響下,同一物種的不同細胞中或同一細胞在不同時期,它的蛋白質(zhì)組也是不斷變化的。因此,為了更好地了解這一動態(tài)的變化過程,蛋白質(zhì)組學(xué)中提出了一個新的領(lǐng)域一亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)(subcellular proteomics)。亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不僅可以減少全蛋白組分析的復(fù)雜性,還可以富集低豐度蛋白,完善全細胞蛋白質(zhì)組,加深對亞細胞組分的結(jié)構(gòu)和功能理解,可以更靈敏的反映病理因素造成的一些蛋白質(zhì)的量變、質(zhì)變和蛋白的遷移情況,有助于人們對生命活動深入而全面的認識。分析細胞在不同狀態(tài)下亞細胞蛋白質(zhì)組的差異表達蛋白,并研究其功能,為我們尋找特性生物標記,探究相關(guān)機理提供了一種強有力的手段。因此,本文我們采用亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略來探討GBM對TMZ的耐藥機制。回顧既往文獻,TMZ耐藥機制的研究多集中于對耐藥株(自然耐藥或誘導(dǎo)耐藥)和敏感株進行比較,對GBM細胞從藥物敏感向不敏感轉(zhuǎn)換過程的研究較少,而我們臨床中發(fā)現(xiàn),GBM對TMZ的耐藥是在TMZ的誘導(dǎo)下逐步發(fā)生的。本實驗室前期采用TMZ(200 μM)持續(xù)刺激人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞細胞系U87,發(fā)現(xiàn)1周(W)時,絕大多數(shù)細胞已經(jīng)死亡,但仍有少量細胞存活。這些存活的細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著變化,胞體、胞核變大,異型性增加,更加顯著的變化表現(xiàn)為細胞向各個方向伸出多個細長偽足。隨著TMZ作用時間的延長,細胞又逐漸恢復(fù)至TMZ處理前培養(yǎng)的細胞形態(tài)。這一現(xiàn)象提示我們GBM細胞受到TMZ持續(xù)作用1 W后仍存活并發(fā)生顯著形態(tài)學(xué)變化的階段,是其由敏感向不敏感轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期,也是與TMZ耐藥的發(fā)生密切相關(guān)的時期。因此,我們選擇該狀態(tài)下的細胞,應(yīng)用亞細胞蛋白組學(xué)的方法,篩選差異蛋白,探討GBM耐藥機制,同時以期發(fā)現(xiàn)新的能夠增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐藥的生物標志物。因此,本研究以膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞系為研究對象,TMZ持續(xù)作用U87細胞1W后提取胞漿和胞核蛋白,采用亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的方法L abel-free法識別、定量蛋白表達的改變,篩選出差異蛋白,然后再通過生物信息學(xué)的方法,采用GO注釋富集分析,KEGG通路注釋及富集分析,聚類分析對篩出蛋白進行顯著性差異分析,找出可能與TMZ耐藥密切相關(guān)的差異蛋白,以期揭示GBMTMZ耐藥機制以及發(fā)現(xiàn)新的能夠增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐藥的生物標志物,為膠質(zhì)母細胞瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。而為了下一步深入探討篩選出的差異蛋白的功能,良好的細胞模型是后續(xù)研究的基礎(chǔ),原代細胞因性質(zhì)和特點上更接近于腫瘤在人體的原始狀態(tài),因此是目前研究腫瘤致病機制、放化療抵抗和腫瘤細胞的分子生物學(xué)特性的最常用的工具。然而,傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤原代細胞培養(yǎng)方法耗時長,操作繁瑣,成功率低,因此我們對其進行了改良,成功培養(yǎng)了足量的原代膠質(zhì)瘤細胞,為下一步細胞水平驗證差異蛋白功能提供了良好的工具。第一部分：TMZ作用U87細胞1W后亞細胞蛋白組學(xué)識別和定量差異蛋白目的：采用亞細胞蛋白組學(xué)label-free法識別和定量TMZ持續(xù)作用U87細胞1周后胞漿蛋白和胞核蛋白差異表達蛋白,篩選與GBM TMZ耐藥密切相關(guān)的差異蛋白及通路,探討TMZ的耐藥機制,以期發(fā)現(xiàn)新的能夠增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐藥的生物標記物。方法：取生長狀態(tài)良好的U87細胞,加入TMZ(200μM)持續(xù)作用1周,使用二甲基亞砜(DMSO)持續(xù)作用1周作為對照組,細胞形態(tài)觀察及檢測以上兩組的存活細胞數(shù)及細胞活力。收集以上各組條件下的U87細胞進行核質(zhì)分離,提取胞漿蛋白和胞核蛋白樣品,考馬斯亮藍法對各組蛋白定量,采用蛋白質(zhì)印跡法、Vestern Blot,兼容質(zhì)譜銀染法及質(zhì)譜分析驗證胞漿蛋白和胞核蛋白純度及處理因素的有效性(所有實驗生物學(xué)重復(fù)3次)。收集生物學(xué)重復(fù)三次的胞漿蛋白和胞核蛋白樣品,采用亞細胞蛋白組學(xué)Label-free法識別和定量各組細胞胞漿蛋白與胞核蛋白,以蛋白含量變化倍數(shù)+/-2.0且P value0.05為篩選標準,篩選差異蛋白,對TMZ組和DMSO組胞漿差異蛋白和胞核差異蛋白在GO功能注釋及KEGG通路注釋基礎(chǔ)上,分別進行GO富集分析和KEGG富集分析,找出與TMZ密切相關(guān)的差異蛋白。結(jié)果：TMZ(200μM)持續(xù)作用U87細胞系1周后,U87細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化,細胞突起變長,細胞胞體變大、變長。實驗組U87細胞活力明顯下降,與DMSO組比較,存活細胞數(shù)也顯著減少。與前期實驗結(jié)果細胞表型相符。各組U87細胞核質(zhì)分離后胞漿蛋白和胞核蛋白定量準確,蛋白總量滿足后續(xù)實驗需求。蛋白質(zhì)印記法Western Blot結(jié)果顯示,各組胞漿蛋白中基本無胞核蛋白表達,胞核蛋白中無胞漿蛋白表達,蛋白間沒有相互污染,核質(zhì)分離成功。兼容質(zhì)譜銀染法結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)條帶清晰,實驗組和對照組間蛋白表達差異明顯。質(zhì)譜分析顯示組內(nèi)樣品信號峰的分布以及質(zhì)譜信號強度相似,而組間樣品信號峰的分布以及質(zhì)譜信號強度差異明顯。亞細胞非標記定量蛋白組學(xué)Label-free法識別和定量各組細胞胞漿蛋白與胞核蛋白表達的改變后,從原始數(shù)據(jù)中質(zhì)譜定性到的蛋白質(zhì)共計3910個。按照篩選標準,共篩選出差異蛋白304種,其中,TMZ組和D MSO組胞漿蛋白篩出差異蛋白數(shù)目148個,上調(diào)蛋白數(shù)量90種,下調(diào)蛋白數(shù)量58種。胞核蛋白篩出差異蛋白156個,上調(diào)蛋白數(shù)量76種,下調(diào)蛋白數(shù)量80種。通過對差異蛋白進行GO富集分析發(fā)現(xiàn),在胞漿蛋白中上調(diào)的差異蛋白在細胞內(nèi)定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程有集中趨勢,細胞內(nèi)定位主要分布在核糖體上,從分子功能看,其主要功能與核糖體結(jié)構(gòu)組分相關(guān),而從參與的生物學(xué)過程看,主要集中在參與翻譯及翻譯后的修飾過程；而在胞漿蛋白中下調(diào)的差異蛋白在細胞內(nèi)定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程上未表現(xiàn)出集中趨勢。在胞核蛋白中上調(diào)差異蛋白在細胞內(nèi)定位及參與的生物學(xué)過程及分子功能上有集中趨勢,從細胞內(nèi)定位分析看上調(diào)差異蛋白主要集中在細胞核上,而分子功能主要與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān),主要參與核酸、含堿基化合物及染色質(zhì)重塑的過程；在胞核蛋白中下調(diào)的差異蛋白在細胞定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程也未出現(xiàn)明顯的集中趨勢且與TMZ的作用沒有明顯的相關(guān)性。差異蛋白KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)在胞漿蛋白中,上調(diào)的差異蛋白主要RNA轉(zhuǎn)運信號通路、Ribosome信號通路及Ribosome biogenesis in eukaryotes信號通路密切相關(guān)。在胞核蛋白中,上調(diào)的差異蛋白主要與mismatch repair信號通路,Transcriptional misregulation in cancer信號通路及Spliceosome信號通路有關(guān)。在胞漿蛋白和胞核蛋白中下調(diào)的差異蛋白中,我們發(fā)現(xiàn)二者均與PI3K-Akt signaling pathway信號通路有關(guān)。此外,在胞核蛋白中下調(diào)的差異蛋白還與MicroRNAs in cancer信號通路相關(guān)。通過GO富集分析及KEGG通路富集分析,我們共篩選出5種可能與TMZ密切相關(guān)的差異蛋白。結(jié)論：本實驗應(yīng)用亞細胞定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label-free技術(shù)研究TMZ持續(xù)作用U87細胞1周后胞漿蛋白和胞核蛋白的差異表達情況,篩選出差異蛋白,通過對差異蛋白GO功能富集分析,我們發(fā)現(xiàn),胞漿蛋白中上調(diào)的差異蛋白主要定位于核糖體上,參與翻譯和翻譯后修飾過程,這提示我們,翻譯及翻譯后修飾過程可能與TMZ耐藥關(guān)系密切,值得下一步深入探討,而在下調(diào)的差異蛋白中,在功能、定位及參與生物學(xué)過程并未發(fā)現(xiàn)有集中趨勢,因此未作進一步分析。在胞核蛋白中上調(diào)的差異蛋白在細胞內(nèi)定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程均有集中趨勢,差異蛋白主要定位在細胞核上,而分子功能主要與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān),主要參與核酸、含堿基化合物及染色質(zhì)重塑的過程。這一個結(jié)果與TMZ引起DNA損傷后出現(xiàn)損傷修復(fù)相符,提示我們胞核蛋白的變化與TMZ耐藥的產(chǎn)生關(guān)系可能更為密切；在胞核蛋白中下調(diào)的差異蛋白在細胞定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程也未出現(xiàn)明顯的集中趨勢且與TMZ的作用沒有明顯的相關(guān)性,因此,在下一步分析中,未對胞核蛋白中下調(diào)的差異蛋白進行深入探討。同時對差異蛋白的可能參與的代謝與信號通路進行KEGG通路富集分析,分別選取了可能與TMZ耐藥密切相關(guān)的信號通路,通過對參與這些通路的差異蛋白篩選,結(jié)合GO功能富集分析,我們共篩選出5種可能與TMZ密切相關(guān)的差異蛋白,為進一步探討TMZ耐藥機制奠定了基礎(chǔ)。第二部分：改良傳統(tǒng)酶消化法人腦膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)目的：探索一種改良的酶消化法人腦膠質(zhì)瘤細胞原代培養(yǎng)的方法,為后期實驗在原代細胞水平驗證蛋白功能提供良好的工具。方法：基于文獻結(jié)合個人經(jīng)驗,改良既往文獻報道的酶消化法膠質(zhì)瘤原代細胞培養(yǎng)方法,對32例不同級別的膠質(zhì)瘤進行原代細胞培養(yǎng),通過倒置相差顯微鏡觀察腫瘤細胞的形態(tài)學(xué)特點；傳代時采用差速貼壁法對原代細胞進行純化；通過細胞免疫熒光對原代細胞進行鑒定；通過細胞增殖實驗(CCK法)繪制生長曲線,研究體外培養(yǎng)細胞的增殖情況,取對數(shù)生長期細胞予以凍存,適時復(fù)蘇,了解細胞凍存效果及復(fù)蘇后細胞形態(tài)及增殖變化。結(jié)果：改良的培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)28例,4例失敗,成功率為87.5%；培養(yǎng)成功的細胞貼壁生長,細胞狀態(tài)穩(wěn)定,形態(tài)各異,生長狀態(tài)良好,并可傳代；細胞免疫熒光顯示膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達陽性,證明培養(yǎng)的細胞為膠質(zhì)瘤細胞；細胞增殖實驗(CCK法)顯示細胞在體外增殖活躍,腫瘤病理級別越高,細胞增殖能力越強。原代細胞復(fù)蘇后細胞生長狀態(tài)良好,細胞形態(tài)較凍存前無明顯變化,細胞增殖活躍,細胞凍存成功。結(jié)論：改良的酶消化法人腦膠質(zhì)瘤細胞原代培養(yǎng)的方法具有簡單,高效,成功率高等優(yōu)點,能夠為后期實驗提供良好的保證。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)母細胞瘤 替莫唑胺 亞細胞蛋白組學(xué) 原代培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-22
• 第一章 亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白的識別和定量22-67
• 一、引言22-23
• 二、材料23-28
• 三、方法28-38
• 四、數(shù)據(jù)分析38-43
• 五、結(jié)果43-62
• 六、討論62-67
• 第二章 改良酶消化法人腦膠質(zhì)瘤細胞快速原代培養(yǎng)67-75
• 一、引言67
• 二、材料和方法67-70
• 三、結(jié)果70-73
• 四、討論73-75
• 全文小結(jié)75-77
• 參考文獻77-82
• 攻讀碩士期間主要成果82-83
• 致謝83-85

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本文編號：427002