本文關鍵詞：Neurexin-1β及Neuroligin-1與蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知功能損害的關系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Neurexin-1β及Neuroligin-1在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織中的表達變化以及與認知功能關系研究目的:建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,研究不同時間點腦組織內Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達變化,以及對大鼠神經(jīng)行為學及認知功能改變的影響。方法:54只成年健康雄性SD大鼠,隨機分為假手術組、SAH后3h、6h、12h、24h、48h、72h、1w、2w共9組,每組6只大鼠。所有SAH大鼠經(jīng)自體尾動脈抽取非肝素化動脈血注入視交叉前池,致蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。分別在蛛網(wǎng)膜下腔出血后3h、6h、12h、24h、48h、72h、1w、2w處死大鼠。假手術組大鼠進行尾動脈采血并予顱骨鉆孔,但未進行注血,于處理后72h處死大鼠。所有大鼠均進行體循環(huán)灌注,并取大腦皮層、海馬組織做標本,進行Western blot及免疫熒光分析,檢測Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達。并取20只成年健康雄性SD大鼠,隨機分為假手術組和SAH組,每組10只大鼠。按以上方法完成假手術或SAH模型制作,所有大鼠在48h后進行神經(jīng)功能評分,并開始進行Morris水迷宮試驗,測試大鼠認知功能改變。結果:1.Western blot結果顯示:與假手術組相比,SAH后3h~24h大鼠腦皮質中Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達水平明顯降低(3h、6h、12h P0.05),SAH后24h~72h表達水平降低最為明顯(24h、48h、72h P0.01),2w組的表達水平與假手術組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。2.免疫熒光結果顯示:在大腦皮層及海馬,與假手術組相比,SAH后Neurexin-1β的相對熒光強度在3h~12h出現(xiàn)下降(3h、6h、12h P0.05),而SAH后24h~72h下降最明顯(24h、48h、72h P0.01),而后回升,至2w時相對免疫熒光強度與假手術組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。Neuroligin-1的相對免疫熒光強度在SAH后6h~48h出現(xiàn)下降(6h、12h、24h、48h P0.05),SAH后72h下降最顯著(72h P0.01),SAH后1w相對免疫熒光強度回升(1w P0.05),其中2w組各部位腦組織Neuroligin-1免疫熒光強度也存在一定差別,在海馬,2w組免疫熒光強度仍低于假手術組(P0.05),而在大腦皮層中則無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.與假手術組相比,SAH組大鼠神經(jīng)功能評分明顯落后,食欲及活動能力均下降(P0.01)。4.在Morris水迷宮試驗中,與假手術組相比,SAH組的逃避潛伏期明顯延長(P0.01),游泳距離顯著增加(P0.01),逃避潛伏期改進百分比下降(P0.01)。結論:1.突觸前膜蛋白Neurexin-1β在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的3h~1w中,在大腦皮層和海馬區(qū)域中的表達均存在不同程度的降低,以24h~72h最明顯,SAH后1w其表達又出現(xiàn)一定程度的回升,至SAH后2w回升至假手術組水平;2.突觸后膜蛋白Neuroligin-1在大鼠SAH后6h開始,在大腦皮質和海馬中,表達出現(xiàn)不同程度的下降,至72h最為明顯,而后又逐漸上升;3.Neuroligin-1表達降低出現(xiàn)的時相晚于Neurexin-1β,其中海馬中表達恢復比大腦皮層中遲緩。4.大鼠在蛛網(wǎng)膜下腔出血后出現(xiàn)認知功能損害,學習記憶功能下降是其表現(xiàn)之一。第二部分Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達的沉默與大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知功能損害的關系研究目的:研究si RNA對Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達的干擾作用及對蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠認知功能損害的影響,并探討其作用機制。方法:80只成年健康雄性SD大鼠,隨機分為五組:假手術組、SAH組、scrambled si RNA組、Neurexin-1βsi RNA組、Neuroligin-1 si RNA組,每組16只大鼠。所有si RNA組大鼠在SAH造模前48小時經(jīng)側腦室注射注入相應的si RNA 500pmmol/只,假手術組及SAH組大鼠注射等體積的生理鹽水。所有SAH大鼠經(jīng)自體尾動脈抽取非肝素化動脈血注入視交叉前池,致蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。假手術組大鼠進行尾動脈采血并予顱骨鉆孔,但未進行注血。每組隨機取6只在SAH后72h處死大鼠,均進行體循環(huán)灌注,并取大腦皮質、海馬組織做標本,進行Western blot及免疫熒光分析,檢測Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達。余下的所有大鼠在SAH后48h進行神經(jīng)功能評分,并開始進行Morris水迷宮試驗,檢測大鼠認知功能的改變。結果:1.Western blot結果顯示:與假手術組相比,SAH組大鼠腦組織中Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達水平明顯降低(P0.01),SAH組與scrambled si RNA組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05),而Neurexin-1βsi RNA組、Neuroligin-1 si RNA組蛋白表達水平與scrambled si RNA組相比均下降(P0.05)。2.免疫熒光結果顯示:在大腦皮層及海馬,與假手術組相比,SAH后Neurexin-1β、Neuroligin-1的相對熒光強度均降低(P0.01),而scrambled si RNA組與SAH組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。Neuroligin-1 si RNA組與scrambled si RNA組相比,熒光強度出現(xiàn)下降(P0.05)。3.與假手術組相比,SAH組大鼠神經(jīng)功能評分明顯落后,食欲及活動能力下降(P0.01)。而與srambled si RNA組相比,Neurexin-1βsi RNA組和Neuroligin-1 si RNA組大鼠神經(jīng)功能評分下降,食欲及活動能力下降(P0.05)。scrambled si RNA組和SAH組之間無統(tǒng)計學意義(P0.5)。4.在Morris水迷宮試驗中,與假手術組相比,SAH組及scrambled si RNA組的學習記憶功能明顯下降(P0.01),且SAH組與scrambled si RNA組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05),Neurexin-1βsi RNA組和Neurexin-1βsi RNA組較SAH組下降(P0.01)。結論:Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達的沉默可使蛛網(wǎng)下腔出血后大鼠的認知功能障礙進一步加重。第三部分Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達的沉默與上調對氧合血紅蛋白共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸樣結構形成的影響目的:研究Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達沉默或上調后,與氧合血紅蛋白共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸樣結構形態(tài)和數(shù)目變化,并探討其作用機制。方法:取孕18天的Wistar大鼠母鼠,麻醉后剖宮取胎鼠,在無菌條件下,在預冷的D-Hank’s玻璃皿中,分離胎鼠大腦,剝離出雙側海馬對,在D-Hank’s液中機械分離,轉入離心管中離心并棄去上清,加入木瓜蛋白酶消化10min,用含有10%FBS的DMEM液終止消化并洗滌,通過200目濾網(wǎng)過濾,離心并棄去上清,加入含有10%FBS的DMEM液,反復吹打成單細胞懸液,常溫下靜置5分鐘,取中層細胞懸浮液,轉入培養(yǎng)瓶中,37℃差速貼壁3h,非神經(jīng)細胞貼壁較快,收獲未貼壁細胞(內含神經(jīng)元可達90%以上),進行吹打后,以0.4%臺盼藍染液染色并計數(shù)活細胞,調整細胞密度為1.0×10^6/ml,種植于0.1mg/ml的多聚-D-賴氨酸包被后的蓋玻片上,將24孔板置于37℃培養(yǎng)箱中。24h內全量換為含2%B-27和0.5m M Gluta MAX?-I的Neurobasal-A培養(yǎng)液,提供5%的CO2氣體,在37℃培養(yǎng)14-19天,其后,每三天置換半量培養(yǎng)液。并定期觀察神經(jīng)元生長情況。培養(yǎng)至第15天,利用Neurexin-1β及Neuroligin-1基因si RNAs、過表達質粒及陰性對照載體轉染海馬神經(jīng)細胞,24h后以20μM氧合血紅蛋白刺激神經(jīng)元并共培養(yǎng)24h,同時設置空白對照和氧合血紅蛋白對照組。進行Western blot和免疫熒光分析。結果:1.Western blot結果顯示:與空白對照組相比,氧合血紅蛋白對照組經(jīng)過與Oxy Hb共培養(yǎng)24h后,其Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達水平均下降(P0.01),Neurexin-1βsi RNA組、Neuroligin-1 si RNA組其目的蛋白表達水平較氧合血紅蛋白對照組出現(xiàn)更加顯著的降低(P0.01),而各過表達組與氧合血紅蛋白對照組相比,相應目的蛋白的表達水平獲得明顯提升。另外,實驗提示突觸前膜標志物Synapsin及突觸后膜標志物PSD95與Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達水平呈現(xiàn)正相關。當Neurexin-1β及Neuroligin-1的基因表達沉默后,Synapsin和PSD95表達水平也出現(xiàn)明顯下降(P0.01),而Neurexin-1β及Neuroligin-1過表達組Synapsin和PSD95的表達也出現(xiàn)明顯上調(P0.01)2.免疫熒光結果顯示:氧合血紅蛋白對照組Neurexin-1β及Neuroligin-1的相對免疫熒光強度較空白對照組顯著下降(P0.01),而與氧合血紅蛋白對照組相比,Neurexin-1βsi RNA組、Neuroligin-1 si RNA組相應目的蛋白的相對免疫熒光強度進一步下降(P0.01),兩個過表達組其目的蛋白的相對免疫熒光強度較血紅蛋白對照組明顯升高(P0.01)。各陰性對照組與氧合血紅蛋白對照組相對熒光強度無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。在Synapsin和PSD95的免疫熒光雙染中,可見到神經(jīng)元之間樹突和軸突相互組合而成的突觸樣結構,Neurexin-1βsi RNA組、Neuroligin-1 si RNA組,其Synapsin和PSD95相對免疫熒光強度較氧合血紅蛋白對照組顯著下降(P0.01),突觸樣結構也明顯減少(P0.01)。而Neurexin-1β及Neuroligin-1過表達后Synapsin和PSD95的相對免疫熒光強度也出現(xiàn)明顯升高(P0.01),突觸樣結構也顯著增多(P0.01)。結論:1.si RNAs和過表達質�？煞謩e引起體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中Neurexin-1β和Neuroligin-1基因表達的沉默與上調;2.突出前膜標志物Synapsin及突觸后膜標志物PSD95與Neurexin-1β及Neuroligin-1的表達水平呈現(xiàn)正相關;3.Neurexin-1β及Neuroligin-1基因表達的沉默可引起與氧合血紅蛋白共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸樣結構減少,而Neurexin-1β及Neuroligin-1基因的過表達可使突觸樣結構增多。
【關鍵詞】：蛛網(wǎng)膜下腔出血 Neurexin-1β Neuroligin-1 認知功能損害 蛛網(wǎng)膜下腔出血 Neurexin-1β Neuroligin-1 認知功能損害 基因表達沉默 Neurexin-1β Neuroligin-1 si RNA 突觸樣結構
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.35
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-15
• 前言15-19
• 參考文獻17-19
• 第一部分Neurexin-1β 及Neuroligin-1 在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織中的表達變化以及與認知功能關系研究19-44
• 材料與方法19-32
• 結果32-38
• 討論38-39
• 結論39-40
• 參考文獻40-44
• 第二部分Neurexin-1β 及Neuroligin-1 基因表達的沉默與大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知功能損害的關系研究44-61
• 材料和方法44-51
• 結果51-56
• 討論56-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-61
• 第三部分Neurexin-1β 及Neuroligin-1 基因表達的沉默與上調對氧合血紅蛋白共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸樣結構形成的影響61-76
• 材料和方法61-67
• 結果67-71
• 討論71-73
• 結論73
• 參考文獻73-76
• 綜述76-88
• 參考文獻81-88
• 中英文縮略詞表88-89
• 攻讀碩士期間公開發(fā)表的論文89-90
• 致謝90-91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周東;李治綱;詹升全;舒航;林志俊;李昭杰;林曉風;曾少建;陳光忠;;動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者認知功能研究[J];中國臨床神經(jīng)外科雜志;2010年02期

  本文關鍵詞：Neurexin-1β及Neuroligin-1與蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知功能損害的關系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：398278