目的：1.檢測2010年9月至2012年12月間中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院就診的9個中國漢族肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson’s disease, WD)患者及家系的ATP7B基因突變類型及突變頻率,并進(jìn)行單體型分析。2.分析肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吲R床特點,鑒定基因型和表型之間的關(guān)系。 方法：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)和基因測序法,檢測9個肝豆?fàn)詈俗冃曰颊�、部分家系成員及正常對照的ATP7B基因突變情況。 結(jié)果：1.9個WD家系中發(fā)現(xiàn)1個純合子ATP7B基因突變家系和8個復(fù)合雜合子ATP7B基因突變家系�？偣灿�11種突變類型,包括1個無義突變(p.Ser105X)、1個移碼突變(c.1708-1G>C)和9個錯義突變(p.Arg778Leu、p.Pro840Leu、p.Ala874Pro、p.Thr888Pro p.Thr935Met、p.Pro992Leu、p.Asp1047Val、p.Ile1148Thr和p.Glu1173Lys),但9例WD患者中未發(fā)現(xiàn)新突變。同時在ATP7B基因突變檢測過程中發(fā)現(xiàn)有8種多態(tài),包括p.Ile390Val、...

【文章頁數(shù)】：112 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
符號說明
第一部分 肝豆?fàn)詈俗冃约蚁礎(chǔ)TP7B基因突變篩查和單體型分析
    1 前言
    2 對象和方法
        2.1 研究對象
            2.1.1 肝豆?fàn)詈俗冃约蚁?br>            2.1.2 正常對照組
        2.2 研究器材和試劑
            2.2.1 主要器材
            2.2.2 主要試劑
            2.2.3 主要配劑
            2.2.4 主要的計算機分析軟件和數(shù)據(jù)庫
        2.3 研究方法和步驟
            2.3.1 DNA準(zhǔn)備
            2.3.2 引物設(shè)計
            2.3.3 PCR(Polymerse chain reaction,聚合酶鏈反應(yīng))反應(yīng)
            2.3.4 PCR產(chǎn)物鑒定
            2.3.5 測序
            2.3.6 單體型分析
            2.3.7 Hardy-Weinberg平衡吻合度測驗
    3 結(jié)果
        3.1 家系突變篩查結(jié)果
            3.1.1 家系篩查結(jié)果
            3.1.2 突變位點結(jié)果分析
            3.1.3 多態(tài)位點結(jié)果分析
            3.1.4 單體型分析
            3.1.5 臨床資料分析
    4 討論
        4.1 肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床特征
        4.2 致病基因
        4.3 ATP7B基因突變
        4.4 WD表型及與基因型可能的關(guān)系
    5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 ATP7B siRNA干擾對HepG2細(xì)胞活性、凋亡及下游蛋白的影響
    1 前言
    2 對象和方法
        2.1 實驗細(xì)胞株
        2.2 研究方法步驟
            2.2.1 主要儀器
            2.2.2 主要試劑及材料
            2.2.3 主要配劑
        2.3 研究方法和步驟
            2.3.1 Small interfering RNA(小分子干擾RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染
            2.3.2 引物設(shè)計
            2.3.3 提取總RNA
            2.3.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.3.5 相對定量熒光PCR(real-time RT-PCR)
            2.3.6 Western Blot
            2.3.7 MTT法測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
            2.3.8 細(xì)胞凋亡測定
            2.3.9 電鏡觀察細(xì)胞凋亡
    3 結(jié)果
        3.1 ATP7BsiRNA干擾結(jié)果分析
        3.2 Hoechst 33342染色結(jié)果分析
        3.3 電鏡結(jié)果分析
        3.4 MTT結(jié)果
        3.5 MCM7、SREBP1、BCL2和BAX基因mRNA表達(dá)結(jié)果分析
        3.6 Western blot結(jié)果分析
    4 討論
    5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間主要的研究成果
致謝



本文編號：3963004