目的:構建攜帶human-VEGF165基因的慢病毒載體,轉染嗅鞘細胞(OECs),探索將human-VEGF165基因導入OECs的方法,分析構建OECs-VEGF基因工程細胞的可行性。方法:差速貼壁法純化OECs,采用免疫熒光鑒定OECs原代細胞純度。使用慢病毒包裝試劑盒,通過三種質粒的共同轉染293T細胞,合成攜帶目的基因的慢病毒載體。熒光實時定量PCR法測定病毒滴度,采用免疫熒光檢測和ELISA檢測OECs-VEGF165基因工程細胞。結果:差速貼壁法所取出的原代細胞約在所有細胞中占98%,第二代約占78%,第三代降至58%,活性也明顯下降,細胞形態(tài)變得多種多樣,增殖變緩。從質粒轉染成功的293T細胞提取的蛋白中檢測到22KD附近處有條帶,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。合成病毒的滴度為2×10⁸個/ml。轉染組GFP陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例大于80%,轉染后MOI為5亞組細胞死亡較少,細胞功能恢復快。轉染成功的OECs觀察到外源VEGFA的表達。結論:差速貼壁法純化是簡便、經(jīng)濟的體外研究OECs的方法,要選擇合適的傳代次數(shù)。通過攜帶有human...

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