本文關鍵詞：RA與WNT信號通路聯(lián)合調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細胞分化的體外研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有自我更新,自我增殖和分化成多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞潛力的未分化的細胞,經(jīng)過神經(jīng)元前體細胞(neural progenitor cells,NPCs)和膠質(zhì)前體細胞階段,最終分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。體外培養(yǎng)NPCs時,表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)具有促進增殖的作用,并最終使NPCs增殖形成具有分化潛能的神經(jīng)球;若撤去促進增殖的因素時,神經(jīng)球?qū)只缮窠?jīng)元、星型膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞;因此對于NPCs研究的重點就在如何控制NPCs向預定的細胞方向分化,并達到對疾病治療的目的。在神經(jīng)球的培養(yǎng)中,許多細胞內(nèi)源性的和外源性的因素均可調(diào)節(jié)NPCs的增殖、遷移和分化;NPC培養(yǎng)技術為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了一個較為理想和可行的細胞培養(yǎng)模型;通過對胚胎、胎兒或者成年機體獲得的NSCs予以適當誘導,然后進行移植治療,對于損傷或疾病所導致的大腦和脊髓的神經(jīng)元變性或許會得到逆轉(zhuǎn)。維甲酸(retinoic acid,RA)是一個由維生素A轉(zhuǎn)化而來的親脂性的小分子化合物,在胚胎形成,發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞,在給予RA刺激時會促進干細胞增殖;對于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng),RA促進干細胞向著膠質(zhì)細胞前體細胞方向的分化以及少突膠質(zhì)-gaba能神經(jīng)元方向的分化。wnt信號通路是器官發(fā)育過程中高度保守的信號通路。不論是在胚胎的神經(jīng)發(fā)生,還是在成年神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞,wnt信號均具有調(diào)節(jié)npcs分化和增殖的作用;對于神經(jīng)變性性和神經(jīng)退行性疾病,wnt信號同樣扮演著十分重要的角色;通過對體外培養(yǎng)的胚胎干細胞進行wnt配體刺激,結果發(fā)現(xiàn)wnt除了能促進干細胞增殖和自我更新,促進神經(jīng)球的形成和增長之外,還具有促進其向gaba能神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞方向的分化的潛能。在發(fā)育中,ra和wnt信號通常作為腹、背兩極的形態(tài)發(fā)生信號,協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)著組織的生長和肝細胞的分化,因此,在神經(jīng)干細胞中,二者有可能協(xié)調(diào)發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖分化。但有關ra和wnt信號相互影響及其相互之間在神經(jīng)干細胞的增殖與分化中相互作用機制的研究目前尚未見報道�；诖�,本實驗擬在體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞的基礎上,研究兩者共同干預nscs時,會對nscs的自我更新和增殖產(chǎn)生什么樣的影響?第一部分ra和wnt信號對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響1.方法:培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細胞;在神經(jīng)干細胞的誘導分化下,進行ra處理、wnt3a處理以及兩者聯(lián)合;采用brdu示蹤方法檢測神經(jīng)干細胞增殖能力的變化;采用免疫細胞化學染色和westernblot技術觀察少突膠質(zhì)-gaba能神經(jīng)元共同前體細胞標記蛋白dlx2,少突膠質(zhì)前體細胞標記蛋白ng2,gaba能神經(jīng)元標記蛋白gad67,神經(jīng)元特異性標記蛋白tuj1,以及星型膠質(zhì)細胞標記蛋白gfap表達的變化。2.結果:ra和wnt3a單獨處理時,均可顯著增加brdu陽性的神經(jīng)干細胞、gaba能神經(jīng)元的gad67陽性的細胞的數(shù)目以及tuj1陽性的神經(jīng)元細胞(p0.05);wnt3a可增加少突膠質(zhì)-gaba能神經(jīng)元的共同前體細胞即dlx2陽性和少突膠質(zhì)前體細胞即ng2陽性的細胞和細胞數(shù)量(p0.05),然而ra抑制dlx2和ng2的表達(p0.05)。ra和wnt3a聯(lián)合使用時,抑制神經(jīng)干細胞增殖,降低dlx2,ng2,gad67以及tuj1神經(jīng)細胞標記物的表達。在神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化時,ra和wnt3a均不同程度地抑制神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化(p0.05),而兩者聯(lián)合使用時gfap陽性的星型膠質(zhì)細胞數(shù)目則有回到了對照組的水平。3.結論:ra和wnt3a均可促進神經(jīng)干細胞增殖和向少突膠-gaba能神經(jīng)元方向的分化的作用,同時抑制其向星形膠質(zhì)細胞方向的分化;ra和wnt3a聯(lián)合使用時,神經(jīng)干細胞增殖、分化能力又恢復到了對照組的水平,提示ra和wnt信號之間可能存在相互拮抗的特性。第二部分ra和wnt信號之間的相互作用及β-catenin對ra/wnt相互拮抗作用的挽救1.方法:培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細胞,采用過表達β-catenin的慢病毒感染神經(jīng)干細胞,然后進行神經(jīng)干細胞的誘導分化,如實驗第一部分方法所述采用brdu增殖實驗檢測神經(jīng)干細胞自我增殖能力的變化,采用免疫細胞化學染色檢測dlx2,ng2,gad67以及gfap的變化,采用westernblot技術檢測ra信號通路和wnt信號通路中相關蛋白的表達。2.結果:ra可上調(diào)wnt/β-catenin信號通路神經(jīng)干細胞中的關鍵分子β-catenin,以及wnt信號的靶基因axin2和cyclind1的表達;wnt3a在ra信號通路中則可上調(diào)ra降解過程中的關鍵酶cyp26b1和下調(diào)ra信號的胞內(nèi)關鍵分子raldh3的表達。ra和wnt3a共同刺激抑制β-catenin的表達。與ra/wnt3a聯(lián)合刺激相比,β-catenin過表達刺激可明顯增加少突膠質(zhì)細胞-gaba能神經(jīng)元的共同前體細胞即dlx2陽性的細胞,少突膠質(zhì)前體細胞即ng2陽性的細胞和gaba能神經(jīng)元的gad67陽性的細胞的數(shù)目以及tuj1陽性的神經(jīng)元細胞(p0.05)和brdu標記的神經(jīng)干細胞(p0.05);而對于神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化出現(xiàn)一定程度的下降,提示β-catenin過表達可挽救ra與wnt信號在神經(jīng)干細胞中的相互拮抗效應。。3.結論:RA和Wnt3a之間互相拮抗的機制可能通過胞內(nèi)β-catenin的作用實現(xiàn),進而抑制神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元方向的分化,而促進其向星型膠質(zhì)細胞方向的分化。由于Wnt3a抑制RA信號通路中Raldh3的合并促進cyp 26B1的表達,Raldh3和cyp 26B1在R與和Wnt3a的相互拮抗中的作用有待進一步研究。
【關鍵詞】：神經(jīng)干細胞 神經(jīng)元前體細胞 維甲酸 Wnt3a Wnt/β-catenin信號 RA信號 少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-27
• 第一部分RA和Wnt信號對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響27-42
• 1 材料27-28
• 2 方法28-33
• 3 結果33-39
• 4 討論39-42
• 第二部分RA和Wnt信號之間的相互作用及 β-catenin對RA/Wnt相互拮抗作用的挽救42-55
• 1 材料43-44
• 2 方法44-47
• 3 結果47-52
• 4 討論52-55
• 小結55-56
• 參考文獻56-64
• 個人簡歷和研究成果64-65
• 致謝65

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