目的探討抑制脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,SYK）對缺氧/缺糖損傷誘導的大腦皮質神經元的凋亡的影響及相關機制。方法分離培養(yǎng)10只SD懷孕大鼠（190²30 g,胎齡16 d）胎鼠的大腦皮質神經元細胞并用MAP2免疫熒光法進行鑒定。建立缺氧/缺糖損傷的體外模型,caspase-3熒光檢測試劑盒檢測caspase-3活性,Annexin-V FITC/PI法檢測細胞凋亡,q RT-PCR檢測SYK和凋亡相關的原癌基因Fra-1 m RNA的表達,Western Blot檢測SYK、Bcl-2和Fra-1蛋白的表達。Control組:無轉染處理的缺氧/缺糖損傷的神經元;SYK siRNA組:轉染SYK siRNA的缺氧/缺糖損傷的神經元;SYK-Fra-1 siRNA組:同時轉染SYK siRNA和Fra-1 siRNA的缺氧/缺糖損傷的神經元;non-specific siRNA組:轉染non-specific siRNA的氧/缺糖損傷的神經元。結果 MAP2免疫熒光鑒定為神經元細胞。缺氧/缺糖損傷誘導神經元SYK表達（P<0.01... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學學報. 2017,39(13)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

缺氧/缺糖損傷皮質神經元中SYK的蛋白電泳圖

:正常細胞組;2:anoxia/hypoglycemia組圖1缺氧/缺糖損傷皮質神經元中SYK的蛋白電泳圖2．3抑制細胞中SYK的表達利用細胞轉染技術抑制經缺氧/缺糖處理的神經元細胞的SYK表達量，為了檢驗轉染效率，我們檢測了SYKmRNA和蛋白表達情況。結果顯示，SYKsiRNA組mRNA表達量(1．27±0．34)相對無轉染處理組(2.82±0．27)和轉染non-specificsiRNA的細胞組(2.95±0．79)明顯下調(P＜0．05)，SYKsiRNA組SYK蛋白表達量(1．27±0．34)相對無轉染處理組(2.54±0．56)和轉染non-specificsiRNA的細胞組(2.83±0．71)明顯下調(P＜0．05)(圖2)。1:無轉染處理;2:轉染SYKsiRNA的細胞;3:轉染non-spe-cificsiRNA的細胞圖2轉染后神經元中SYK的蛋白電泳圖2．4抑制SYK表達降低缺氧/缺糖損傷誘導的皮質神經元細胞的凋亡為了檢測抑制SYK對缺氧/缺糖損傷誘導的皮質神經元細胞凋亡的影響，我們采用了caspase-3活性檢測和Annexin-VFITC/PI方法測定細胞凋亡情況。結果顯示，SYKsiRNA組中caspase-3活性(0．16±0．04)較無轉染處理組(0．42±0．02)和轉染non-specificsiRNA的細胞組(0．46±0．11)顯著降低(P＜0．01)。SYKsiRNA組細胞凋亡率(20．00±5．57)%較無轉染處理組(51．00±3．90)%和轉染non-specificsiRNA的細胞組(57．70±8．08)%顯著降低(P＜0．05)(圖3)。http://aammt．tmmu．edu．cn第三軍醫(yī)大學學報，2017，39(13)1383

1:Control;2:SYKsiRNA組;3:non-specificsiRNA圖3細胞流式檢測抑制SYK對神經元凋亡的影響2．5抑制SYK表達使Fra-1表達量上調為了探究抑制SYK對皮質神經元缺氧/缺糖損傷起保護作用的可能機制，我們檢測了SYK受到抑制后經缺氧/缺糖處理的神經元細胞中Fra-1的表達情況。結果顯示，與對照組(0．93±0．11)和non-specificsiRNA組(1．18±0．41)相比，SYKsiRNA組(2．79±0．37)中Fra-1mRNA表達量明顯上調(P＜0．01);與對照組(1．03±0．05)和non-specificsiRNA組(1．27±0．49)相比，SYKsiRNA組(2．49±0．42)Fra-1蛋白表達量也明顯上調(P＜0．05)(圖4)。1:Control;2:SYKsiRNA組;3:non-specificsiRNA組圖4WesternBlot檢測抑制SYK對Fra-1表達量的影響2．6同時抑制SYK和Fra-1促進缺氧/缺糖對皮質神經元細胞的損傷為了進一步探究可能的機制，我們利用細胞轉染技術同時抑制SYK和Fra-1的表達量，為了檢測轉染效率，我們檢測了SYK和Fra-1的蛋白表達量。結果顯示，SYK-Fra-1-siRNA組中SYK和Fra-1的蛋白表達量較non-specificsiRNA組中均顯著下降(圖5)。然后，我們將兩者表達量同時收到抑制的細胞進行缺氧/缺糖處理，檢測caspase-3活性和Bcl-2蛋白表達量。結果顯示SYK-Fra-1-siRNA組中caspase-3活性(0.530±0.045)相對于SYKsiRNA組(0．240±0．085)顯著上升(P＜0．01)，與non-specificsiRNA組(0．590±0.003)接近。SYK-Fra-1-siRNA組中Bcl-2蛋白表達量(1．31±0．25)相對于SYKsiRNA組(4．47±0．43)顯著下降(P＜0．01)，與non-specificsiRNA組(1．68±0．07)接近(圖6)。1:non-specificsiRNA組;2:SYKsiRNA組;3:SYK-Fra-1-siRNA組A:同時抑制SYK和Fra-1后兩者的蛋白電泳圖;B:同時抑制SYK和Fra-1后兩者的蛋白變化量(n=3，x珋±s);SYK-Fra-1-s


本文編號：3367775