本文關(guān)鍵詞：番茄紅素對轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病,上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均受累,臨床上主要表現(xiàn)為肌肉逐漸萎縮與無力,最后在3-5年內(nèi)因呼吸衰竭而死亡。5-10%的ALS是家族性ALS(f ALS),90%ALS是散發(fā)性ALS(s ALS)。關(guān)于ALS的發(fā)病機(jī)制,目前尚未完全清楚,可能與超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變、氧化應(yīng)激、免疫學(xué)機(jī)制、線粒體功能障礙、神經(jīng)元周圍膠質(zhì)細(xì)胞的異常、氧化毒性等有關(guān),而突變的SOD1基因被認(rèn)為是引起f ALS最常見的基因,現(xiàn)已報(bào)道了多個(gè)SOD1突變位點(diǎn),其中以G93A突變位點(diǎn)最多,而向小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入人突變的SODl-G93A后,小鼠模型也因與人有類似的臨床發(fā)病特點(diǎn)而成為世界上公認(rèn)的研究ALS的動(dòng)物模型。隨著大量研究的進(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙在ALS發(fā)生發(fā)展過程中起著非常關(guān)鍵的作用,線粒體功能障礙有可能是ALS發(fā)病的始動(dòng)因素,而與ALS發(fā)病密切相關(guān)的SOD1就在線粒體上定位存在。更有研究發(fā)現(xiàn),在ALS患者以及動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞中的確存在著大量形態(tài)異常的線粒體和突變蛋白的蓄積。SOD1的主要功能是通過歧化反應(yīng)將線粒體內(nèi)的有毒物質(zhì)(如ROS)氧化,從而達(dá)到解毒的目的。而SOD1基因發(fā)生基因突變時(shí),SOD1與鋅的結(jié)合力下降,從而導(dǎo)致了對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的毒性,而引起患者出現(xiàn)線粒體空泡化和膨脹。并且,SOD1突變的蛋白凝集物會(huì)阻礙線粒體的運(yùn)輸通道,抑制線粒體的生物學(xué)功能,從而造成線粒體損傷,同時(shí)激活細(xì)胞凋亡因子,造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡而發(fā)生ALS。動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin related protein1,Drp1)與線粒體動(dòng)態(tài)變化有密切聯(lián)系,是介導(dǎo)線粒體分裂的因子,在正常狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)的Drp1大部分位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,大約只有3%結(jié)合在線粒體的外膜上。哺乳動(dòng)物的線粒體進(jìn)行分裂時(shí),線粒體分裂蛋白1(Fis1)會(huì)促進(jìn)Drp1聚集到線粒體的外膜上,以促使線粒體發(fā)生分裂,故Drp1表達(dá)增強(qiáng)可致線粒體持續(xù)分裂而引起細(xì)胞凋亡。PC12細(xì)胞為大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,該細(xì)胞富含合成及分解多巴胺所必須的酪氨酸羥化酶,單胺氧化酶等,其化學(xué)特性十分接近中腦多巴胺能神經(jīng)元,同時(shí)具備瘤細(xì)胞特性,因此廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的研究。番茄紅素(lycopene)是一種類胡蘿卜素,是存在于植物中的一種天然色素,主要存在于番茄、胡蘿卜、西瓜和番石榴中,其中番茄的含量最高,目前它是自然界的植物中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一,具有很強(qiáng)的抗氧化作用和清除自由基的能力,具有預(yù)防心臟病、保護(hù)心血管、減緩動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防多種癌癥、抗老化、保護(hù)皮膚等多種生理功能。其在阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)等神經(jīng)變性疾病中的保護(hù)作用已得到證實(shí),但在ALS方面卻未有報(bào)道。目的:本實(shí)驗(yàn)采用SOD1-G93A轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞制備ALS細(xì)胞模型,探討番茄紅素對轉(zhuǎn)染所致的PC12細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用。方法:采用空(Empty,E)質(zhì)粒、野生型(Wild Type,WT)質(zhì)粒、SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,選擇轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%及以上的細(xì)胞孔,CCK-8檢測細(xì)胞活力,并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。給予正常培養(yǎng)的細(xì)胞不同濃度的番茄紅素(0、1、10、20、50、100μmol?L)處理,CCK-8檢測細(xì)胞活力,觀察藥物對細(xì)胞的作用。使用SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞,選擇達(dá)轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞孔,分別給予不同低濃度的番茄紅素(0、0.1、0.5、1、5、10、20μmol?L)處理,CCK-8檢測細(xì)胞活力,篩選番茄紅素的最適藥物濃度。將細(xì)胞分為正常細(xì)胞組,轉(zhuǎn)染E質(zhì)粒組(E),轉(zhuǎn)染W(wǎng)T質(zhì)粒組(WT),轉(zhuǎn)染SOD1-G93A組(SOD1-G93A)。各組均分為空白對照組、番茄紅素組,每組3個(gè)孔。番茄紅素組使用含最適藥物濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,對照組給予普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后,mitotraker染色流式細(xì)胞儀檢測ROS水平,激光共聚焦顯微鏡觀察Drp1的變化,以觀察番茄紅素對SOD1-G93A轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞所致線粒體損傷的保護(hù)作用。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染E、WT、SOD1-G93A質(zhì)粒后,顯微鏡下觀察,選擇轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%及以上的細(xì)胞孔,CCK-8檢測細(xì)胞活力,E、WT、SOD1-G93A組與對照組比較,細(xì)胞活力逐漸下降,SOD1-G93A組細(xì)胞活力下降最明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。E組與WT組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SOD1-G93A組與E、WT組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05),說明造模成功。2 CCK-8檢測結(jié)果顯示給予正常細(xì)胞不同濃度的番茄紅素后,20μmol?L、50μmol?L、100μmol?L組與對照組比較,細(xì)胞活力明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05),說明高濃度的番茄紅素可對細(xì)胞生長、存活產(chǎn)生不利影響,不可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。給予轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的細(xì)胞低濃度的番茄紅素后,與對照組比較,細(xì)胞活力逐漸升高,至藥物濃度為10μmol?L時(shí),細(xì)胞活力達(dá)最高,后又下降,因此篩選出可用于實(shí)驗(yàn)的最適藥物濃度為10μmol?L。3轉(zhuǎn)染W(wǎng)T質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染E質(zhì)粒的PC12細(xì)胞相比,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(P㩳0.05),轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞與轉(zhuǎn)染E質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染W(wǎng)T質(zhì)粒的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染表達(dá)G93A的PC12細(xì)胞ROS水平明顯升高(P㩳0.05)。轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞與轉(zhuǎn)染E質(zhì)粒、WT質(zhì)粒的細(xì)胞相比,Drp1水平明顯升高,說明轉(zhuǎn)染表達(dá)G93A的PC12細(xì)胞存在線粒體損傷。4用最適藥物濃度的番茄紅素干預(yù)PC12細(xì)胞,E、WT、SOD1-G93A各組番茄紅素組與對照組比較,ROS含量均明顯降低(P㩳0.05),Drp1含量減少。結(jié)論:1成功制備了ALS的細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染表達(dá)SOD1-G93A的PC12細(xì)胞存在線粒體損傷。2合適濃度的番茄紅素可提高細(xì)胞活力,對G93A-SOD1轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞有保護(hù)作用。3番茄紅素可協(xié)助清除ALS細(xì)胞模型內(nèi)過量堆積的活性氧及降低Drp1的含量,這可能是番茄紅素保護(hù)線粒體、減輕細(xì)胞損傷的可能機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化 番茄紅素 PC12細(xì)胞 線粒體 活性氧 動(dòng)力相關(guān)蛋白
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R744.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-28
• 附表28-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 綜述 番茄紅素的研究進(jìn)展35-46
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 致謝46-47
• 個(gè)人簡歷47

【參考文獻(xiàn)】

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1 屈明s，

本文編號(hào)：331600