發(fā)布時間：2021-06-25 11:03

　　杜興肌肉萎縮癥（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一種致死性的X染色體連鎖隱性遺傳神經(jīng)肌肉失調(diào)癥,由于DMD基因突變,導致功能性dystrophin蛋白缺失所致,目前臨床上缺乏有效的治療手段。其臨床表征主要為全身肌肉進行性退化萎縮,最終致死。在本研究中,擬對臨床常用的食品級小分子化合物進行篩選和鑒定,通過在DMD小鼠（mdx）模型上的局部和系統(tǒng)測試,以期發(fā)現(xiàn)能夠改善mdx小鼠肌肉病理、炎癥和促進肌肉再生及分化的小分子化合物,為DMD輔助治療提供新的候選藥物。首先利用體外肌肉細胞模型,通過細胞計數(shù)法檢測細胞增殖速度,以篩選能夠增強細胞增殖的候選小分子化合物。在mdx小鼠模型上,對候選小分子化合物進行局部和系統(tǒng)篩選測試,通過免疫熒光、膠原和炎癥病理染色等方法,以確認候選化合物對肌肉再生和病理的改善作用。為檢測不同給藥途徑,對候選化合物作用效果的影響,擬測試飼喂和尾靜脈注射兩種途徑,通過免疫熒光染色、H&E染色等方法,以確認不同給藥方式對候選小分子化合物作用效果的影響。為測試候選化合物長期的作用效果,擬對mdx小鼠進行為期3月的系統(tǒng)治療,通過抓力測試、... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

Dystrophin蛋白結(jié)構(gòu)示例圖

結(jié)果2.1 小分子化合物在杜興肌肉萎縮癥上的篩選和鑒定2.1.1 小分子化合物的體外篩選前期報道不同的營養(yǎng)物質(zhì)如支鏈氨基酸，精氨酸等應用于 DMD 病人的臨輔助治療，但其效果有限[6]-[11]。為了篩選更有效的小分子化合物，我們利用鼠 C2C12 成肌細胞模型，通過篩選能夠促進肌肉細胞增殖的小分子化合物，期發(fā)現(xiàn)改善 DMD 臨床病癥的小分子化合物。通過細胞計數(shù)來檢測細胞增殖況，我們發(fā)現(xiàn)在 G1、G2、G3、G4、G5、G6 和 G7 這幾類小分子化合物中，GG2、G3 和 G5 對細胞增殖作用最為明顯，其中 G1 效果最強，經(jīng) 24h 處理后使細胞數(shù)目由 8000 個增殖到 25000 個，相對于 10% FBS 正常培養(yǎng)基處理組，有顯著性差異，結(jié)果見圖 2A，B。進一步選用 cck8 試劑盒進行細胞增殖活性測，結(jié)果表明 G1、G3 和 G5 相對于正常培養(yǎng)組，其細胞活性的 ratio 比能達1.7（圖 2C），綜上說明，G1、G2、G3 和 G5 是促進肌肉細胞增殖的候選化合物

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 結(jié)果處理后的細胞個數(shù)統(tǒng)計（*P < 0.05, n=3）。（C）CCK8 試劑盒檢測的細胞活性統(tǒng)計（*P< 0.05, n=3）。2.1.2 候選小分子化合物在 mdx 小鼠上的局部篩選體外測試結(jié)果顯示：G1、G2、G3 和 G5 對肌肉細胞表現(xiàn)為更強的促進增殖效果，為驗證這些候選小分子化合物在體內(nèi)的作用效果，本研究將在 mdx 小鼠上進行局部篩選。分別將 G1、G2、G3 和 G5 在 mdx 小鼠前肌骨肌肉上測試，使用濃度均為 5%，以生理鹽水在前脛骨肌肉上測試為對照，單次注射，注射 3天后收樣，檢測小鼠肌肉的新生情況。利用 IHC 檢測新生肌纖維標記蛋白（eMyHC）陽性肌纖維的分布和表達情況，結(jié)果顯示：在這四種處理組中，相對于生理鹽水對照組，G1 處理組 eMyHC 陽性肌纖維分布更為均一，數(shù)量更多，能達到 300 個，其次為 G3，eMyHC 陽性肌纖維數(shù)能達到 200 個，說明 G1 誘導新生肌纖維產(chǎn)生的效果較佳（圖 3）。


本文編號：3249094