本文關(guān)鍵詞：山黧豆神經(jīng)性中毒的細(xì)胞信號(hào)途徑及分子機(jī)理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：山黧豆(Lathyrus sativas L.)是優(yōu)良的旱地作物種質(zhì)資源,長(zhǎng)期過(guò)量食用會(huì)導(dǎo)致人畜神經(jīng)性山黧豆中毒(Neurolathyrism)。神經(jīng)性山黧豆中毒是一種由β-ODAP引起的人畜神經(jīng)退行性疾病,但其細(xì)胞及分子機(jī)理尚不明確。本研究采用離體培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系M059K作為實(shí)驗(yàn)體系,以谷氨酸為對(duì)照,采用從山黧豆種子提取純的β-ODAP,使用濃度梯度的藥物處理細(xì)胞,通過(guò)分析細(xì)胞存活力與生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)確定加藥濃度,利用流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等相關(guān)技術(shù)追蹤檢測(cè)β-ODAP對(duì)細(xì)胞增殖力、細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞周期的變化、細(xì)胞死亡方式與DNA損傷、線粒體膜電位與細(xì)胞骨架、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)狀況和基因差異表達(dá)的動(dòng)態(tài)方面對(duì)細(xì)胞的影響的。最終通過(guò)經(jīng)典數(shù)理統(tǒng)計(jì)、顯微實(shí)證和分子表達(dá)路徑分析方法,主要得出如下結(jié)果：1.通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),用2-22 mM共10個(gè)濃度梯度β-ODAP及Glu處理細(xì)胞后測(cè)得的OD值,繪制細(xì)胞抑制曲線,計(jì)算得到半抑制濃度IC50=17.70 mM,為了更好地模擬體外中毒的過(guò)程,避免Glu對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用干擾研究,確定將10mM藥物濃度作為本研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)的施加劑量,此時(shí)β-ODAP造成的細(xì)胞抑制率為24.6%,Glu為0.2%。2.毒素β-ODAP處理細(xì)胞,使用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞并未出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象,不同藥物處理時(shí)間下凋亡細(xì)胞比例均低于2%；進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象；免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA斷裂狀況,未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA損傷；進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象；免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA斷裂狀況,未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA損傷,細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,β-ODAP可抑制細(xì)胞增殖,顯著降低克隆形成;3.毒素β-ODAP處理細(xì)胞后,使用Fluo 3-AM及Mito-Tracker M7512分別標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鈣離子和線粒體,利用免疫組化實(shí)驗(yàn)觀測(cè)二者變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-ODAP處理6h后便可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子持續(xù)增多并被線粒體吸收,這種現(xiàn)象隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而加劇,處理24 h后部分細(xì)胞中線粒體失活。而Glu處理后鈣離子增加速度低于β-ODAP組；使用Rho 123作為指示劑,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位也觀測(cè)到β-ODAP引起的持續(xù)性膜電位下降。4.毒素β-ODAP處理顯著性地破壞細(xì)胞骨架。毒素處理細(xì)胞后,使用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架,觀測(cè)結(jié)果顯示β-ODAP可影響細(xì)胞骨架嚴(yán)重變形坍塌,綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱,F-actin聚合體發(fā)生翻轉(zhuǎn)和折疊,與細(xì)胞核分離,微絲的胞間連接出現(xiàn)斷裂。5.基因檢測(cè)和表達(dá)結(jié)果分析表明,毒素β-ODAP處理細(xì)胞24 h后,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-ODAP會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)和黏著斑等通路上的Integrinβ1、Laminin、Fibronectin、Paxillin等16條基因差別表達(dá),同時(shí)引起多種其他神經(jīng)退行性疾病通路中的關(guān)鍵致病基因上調(diào)。6.勾畫(huà)了毒素中毒的細(xì)胞信號(hào)途徑和初步揭示了其分子機(jī)理。上述研究結(jié)果表明,β-ODAP造成的細(xì)胞凋亡和壞死并不是其損傷神經(jīng)元的主要方式,毒素β-ODAP可以結(jié)合并異常激活神經(jīng)細(xì)胞的AMPA受體,使得β1整合蛋細(xì)胞表面表達(dá)量上升,進(jìn)一步使黏著斑激酶磷酸化增加,FA蛋白單元在細(xì)胞微絲上大量聚集,誘使樁蛋白的表達(dá)量上調(diào),影響細(xì)胞骨架聚合,最終引起神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)障礙。此外,大量?jī)?nèi)流的Ca2+導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào),細(xì)胞生存力和增值率迅速下降,線粒體攝取過(guò)多的Ca2+引起線粒體膜電位改變,使ATP合成受阻,ROS生成增加,進(jìn)而對(duì)生物膜造成損傷,也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷而死亡。上述研究結(jié)果表明,β-ODAP造成的細(xì)胞凋亡和壞死并不是其損傷神經(jīng)元的主要方式,毒素β-ODAP可以結(jié)合并異常激活神經(jīng)細(xì)胞的AMPA受體,導(dǎo)致Ca2+產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)流,使得p1整合蛋細(xì)胞表面表達(dá)量上升,進(jìn)一步使黏著斑激酶磷酸化增加,黏著斑蛋白單元在細(xì)胞微絲上大量聚集,誘使樁蛋白的表達(dá)量上調(diào),影響細(xì)胞骨架聚合,最終引起神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)障礙。此外,大量?jī)?nèi)流的Ca2+導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào),細(xì)胞生存力和增值率迅速下降,線粒體攝取過(guò)多的Ca2+引起線粒體膜電位改變,使ATP合成受阻,ROS生成增加,進(jìn)而對(duì)生物膜造成損傷,也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷而死亡。綜上所述,山黧豆神經(jīng)性中毒的信號(hào)途徑非常復(fù)雜,涉及不同層次和不同途徑的多基因調(diào)控。本研究首次采用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外模擬的方式,對(duì)山黧豆神經(jīng)性中毒的細(xì)胞信號(hào)途徑和分子機(jī)理進(jìn)行初步探索,初步勾畫(huà)了山黧豆中毒的細(xì)胞信號(hào)通道、基因差異表達(dá)和調(diào)控途徑,為將來(lái)防控和治愈山黧豆中毒提供理論參照。但限于作者的研究周期只有兩年,研究手段尚存在不足,暫未對(duì)β-ODAP分子進(jìn)行標(biāo)記和定位,相關(guān)研究有待將來(lái)進(jìn)一步完善。
【關(guān)鍵詞】：L-β-N-草酰-α β-二氨基丙酸 神經(jīng)性山黧豆中毒 神經(jīng)退行性疾病 鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào) 氧化脅迫 基因表達(dá)概況分析 細(xì)胞骨架 線粒體膜電位 細(xì)胞外基質(zhì)與受體作用
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741;R595
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 山黧豆作為重要種質(zhì)資源在全球變化和糧食安全中的作用12
• 1.2 山黧豆中毒發(fā)生的歷史背景12-14
• 1.3 山黧豆中毒機(jī)理的研究進(jìn)展14-20
• 1.3.1 β-ODAP引起神經(jīng)性中毒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)14-15
• 1.3.2 影響神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸正常功能15-16
• 1.3.3 破壞神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)16-17
• 1.3.4 加劇氧化脅迫破壞線粒體功能17-19
• 1.3.5 神經(jīng)性山黧豆中毒與神經(jīng)退行性疾病19-20
• 1.4 神經(jīng)性山黧豆中毒機(jī)理研究的不足20-21
• 第二章 立項(xiàng)依據(jù)及研究?jī)?nèi)容21-24
• 2.1 立項(xiàng)依據(jù)21-22
• 2.2 研究?jī)?nèi)容及流程圖22-23
• 2.3 主要儀器及藥品耗材23-24
• 2.3.1 主要儀器簡(jiǎn)介23
• 2.3.2 主要耗材23-24
• 第三章 毒素β-ODAP對(duì)細(xì)胞生存率、細(xì)胞周期及死亡動(dòng)態(tài)的影響24-38
• 3.1 材料與方法24-30
• 3.1.1 材料24-25
• 3.1.2 方法25-30
• 3.2 結(jié)果30-37
• 3.2.1 細(xì)胞生存力的變化30-31
• 3.2.2 細(xì)胞形態(tài)的變化31
• 3.2.3 細(xì)胞克隆形成率的變化31-32
• 3.2.4 細(xì)胞死亡動(dòng)態(tài)32-35
• 3.2.5 細(xì)胞周期的變化35-36
• 3.2.6 DNA損傷的狀況36-37
• 3.3 討論37-38
• 第四章 毒素β-ODAP對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的影響38-49
• 4.1 材料與方法38-40
• 4.1.1 材料38-39
• 4.1.2 方法39-40
• 4.2 結(jié)果40-46
• 4.2.2 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化40-43
• 4.2.2 線粒體膜電位的變化43-44
• 4.2.3 細(xì)胞骨架損傷的狀況44-46
• 4.3 討論46-49
• 4.3.1 β-ODAP與Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)失調(diào)46
• 4.3.2 β-ODAP與氧化損傷46-47
• 4.3.3 β-ODAP與細(xì)胞骨架解體47-49
• 第五章 毒素β-ODAP對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)狀況的影響49-65
• 5.1 材料與方法49-53
• 5.1.1 材料49-51
• 5.1.2 方法51-53
• 5.2 結(jié)果53-62
• 5.2.1 M059K細(xì)胞系的表達(dá)譜分析53-60
• 5.2.2 qRT-PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證60-62
• 5.3 討論62-65
• 5.3.1 β-ODAP與基因差別表達(dá)活性62-65
• 第六章 經(jīng)性山黧豆中毒癥與其他神經(jīng)退行性疾病關(guān)系的探討65-69
• 6.1 不同神經(jīng)退行性疾病之間的異同點(diǎn)65-66
• 6.2 不同神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系66
• 6.3 神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元死亡主要方式的探討66-69
• 第七章 主要結(jié)論及展望69-72
• 7.1 β-ODAP觸發(fā)神經(jīng)元損傷的機(jī)理69-71
• 7.2 神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元死亡的主要方式71-72
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 在學(xué)期間的研究成果78-79
• 基金項(xiàng)目資助79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張曉暉,姚天明,黃高f,王文亮;細(xì)胞凋亡的最新研究進(jìn)展[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年S1期

2 劉緒川;張國(guó)偉;李雅茹;王菊香;梁兆年;史燈;鄭玉蓮;;山黧豆有毒成分(BOAA)小鼠急性中毒試驗(yàn)[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;1987年01期

  本文關(guān)鍵詞：山黧豆神經(jīng)性中毒的細(xì)胞信號(hào)途徑及分子機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322842