本文關鍵詞：丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷自噬的影響及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過丁苯酞、SP600125(JNK的特異性抑制劑)對缺血再灌注大鼠模型進行干預,借助Western blot、HE染色、TUNEL、透射電鏡等實驗方法,探討丁苯酞對缺血再灌注損傷后自噬的影響及其與自噬相關蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ的變化;JNK3信號通路是否參與缺血再灌注損傷中自噬的調(diào)控;丁苯酞對自噬的影響是否通過JNK3信號通路來調(diào)控的。方法:將100只(250-300)g健康雄性SD大鼠隨機分為五組:假手術(shù)組、模型組、丁苯酞干預組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組。每組20只大鼠。丁苯酞組及丁苯酞+SP600125組于造模前一星期開始每天給予8 mg·m L-1的NBP溶液1 m L·100 g-1灌胃;假手術(shù)組、SP600125組、模型組給予單純麻油1 m L·100 g-1。同時SP600125組及丁苯酞+SP600125組予以SP600125與40%PEG400配成1mg·m L-1溶液1 m L·100 g-1腹腔注射給藥。假手術(shù)組、模型組、丁苯酞組予以同等劑量(40%PEG400)1 m L·100 g-1腹腔注射。Longa線栓法制作大鼠MCAO模型缺血2小時再灌注12小時。使用Longa評分法評價神經(jīng)功能缺損;分別采用TTC染色判斷缺血再灌注模型是否成功;HE染色檢測腦組織病理變化;血清NSE含量評估腦缺血再灌注損傷后腦功能的損害;原位末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)檢測缺血再灌注損傷后CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡與壞死;通過透射電鏡觀察缺血再灌注損傷后CA1區(qū)神經(jīng)細胞內(nèi)自噬體形態(tài)、數(shù)量;WesternBlot檢測大鼠CA1區(qū)自噬相關蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ的表達和JNK3信號通路相關蛋白JNK3,p-JNK的表達。結(jié)果:1.Longa評分:(1)首次評分:假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組(2.00±0.82)較假手術(shù)組(0)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);NBP治療組(1.83±0.50)、SP600125組(1.88±0.52)及NBP+SP600125組(1.85±0.41)三組兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),但分別與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(2)缺血再灌注12小時后評分:模型組(2.65±0.50)分別與首次評分及假手術(shù)組(0)比較均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);NBP治療組(1.53±0.52)、SP600125組(1.55±0.43)及NBP+SP600125組(1.58±0.55)三組兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),但較模型組及首次評分均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.TTC染色:假手術(shù)組腦組織染色為鮮紅色,模型組、丁苯酞組、丁苯酞+SP600125組、SP600125組均可見皮層及皮層下有明顯的白色梗死灶,各組相對梗死灶體積分別為:模型組(25.56±1.86)較假手術(shù)組(0)比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);丁苯酞組(18.26±2.23),丁苯肽+SP600125組(17.86±2.12),SP600125組(17.98±2.52)三組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),但分別與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.HE染色:各組海馬CAl區(qū)變化:假手術(shù)組,神經(jīng)元排列整齊,形態(tài)圓形較規(guī)整,數(shù)量正常,胞漿均勻紅染,核大而圓呈淡藍色,核膜邊界清晰;模型組,神經(jīng)元排列紊亂,數(shù)量顯著降低,胞漿皺縮空泡形成,胞核固縮呈藍紫色;丁苯酞組、丁苯酞+SP600125組、SP600125組三者兩兩比較無明顯差異,可見大量神經(jīng)元存活,邊界尚清,形態(tài)較規(guī)整,胞核形狀較規(guī)則邊界清晰,少數(shù)細胞出現(xiàn)核染色加深,胞漿部分消失等變性表現(xiàn)。4.TUNEL染色:各組海馬CAl區(qū)神經(jīng)元凋亡表達量為:模型組(0.52±0.05)分別與假手術(shù)組(0.05±0.02)、丁苯酞組(0.31±0.03)、SP600125組(0.30±0.02)以及丁苯酞+SP600125組(0.32±0.04)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。丁苯酞組(0.31±0.03)、SP600125組(0.30±0.02)以及丁苯酞+SP600125組(0.32±0.04),三組之間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。5.NSE-ELISA測定:假手術(shù)組(1.89±0.13)、丁苯酞組(5.10±0.15)、SP600125組(5.21±0.11)以及丁苯酞+SP600125組(5.05±0.15)分別與模型組(9.83±0.21)比較,結(jié)果表明血清NSE含量均低于模型,差異有顯著統(tǒng)計學意義(p0.01)。而丁苯酞組、SP600125組以及丁苯+SP600125組三者之間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。6.westem blot:實驗結(jié)果示:p-JNK、JNK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平模型組比丁苯酞組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組、假手術(shù)組(A組)比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而丁苯酞組、SP600125組、丁苯酞+SP600125組三者之間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。7.透射電鏡:各組CA1區(qū)電鏡:假手術(shù)組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)基本正常,線粒體無腫脹,未見自噬體;模型組可見泡狀的自噬溶酶體,神經(jīng)元細胞核染色質(zhì)固縮;丁苯酞組、SP600125組、SP600125+丁苯酞組可見雙層膜結(jié)構(gòu)形成,包繞細胞器形成自噬體,少量圓形溶酶體,大多位于細胞核旁,同時可見初級溶酶體、次級溶酶體數(shù)量增多以及線粒體腫脹。結(jié)論:1.大鼠腦缺血再灌注損傷后可誘發(fā)自噬的過度激活;2.JNK3信號通路參與了大鼠腦缺血再灌注損傷中對自噬的調(diào)控;3.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用與自噬現(xiàn)象有關;其主要是通過下調(diào)JNK3、p-JNK的表達減弱腦缺血再灌注誘發(fā)的過度自噬而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【關鍵詞】：丁苯酞 腦缺血再灌注 自噬 JNK信號通路 SP600125
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 中英文縮略詞表16-17
• 第一章 前言17-19
• 第二章 材料和方法19-27
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 主要儀器19
• 2.1.2 主要耗材19-20
• 2.1.3 溶液配置20-21
• 2.2 實驗方法21-26
• 2.2.1 實驗動物分組21
• 2.2.2 大鼠MCAO再灌注模型制作21-23
• 2.2.3 TTC染色23
• 2.2.4 大鼠大腦的固定制作23
• 2.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡23
• 2.2.6 石蠟包埋及切片制作23-24
• 2.2.7 HE染色24
• 2.2.8 Western blot24-25
• 2.2.9 血清NSE檢測25
• 2.2.10 透射電鏡25-26
• 2.4 動物倫理26
• 2.5 統(tǒng)計學分析26-27
• 第三章 結(jié)果27-32
• 3.1 模型評估27
• 3.2 TTC 染色結(jié)果27-28
• 3.3 海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元HE染色觀察28
• 3.4 NSE 水平28-29
• 3.5.海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色觀察29
• 3.6 Western Blot蛋白檢測29-31
• 3.7 透射電鏡31-32
• 第四章討論32-38
• 4.1 動物模型的評價32-33
• 4.2 腦缺血再灌注后自噬的激活33-34
• 4.3 JNK3信號通路與腦缺血再灌注損傷34
• 4.4 作用機制34-36
• 4.5 展望36-38
• 第五章 結(jié)論38
• 參考文獻38-42
• 附圖42-51
• 綜述51-59
• 參考文獻55-59
• 研究生期間參與的科研項目及發(fā)表的論文59-60
• 致謝60

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本文編號：290566