發(fā)布時(shí)間：2020-10-14 21:36

　　 研究背景神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)的先天性缺陷,由于胚胎時(shí)期神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中閉合異常引起,主要表現(xiàn)各種腦畸形。神經(jīng)上皮細(xì)胞即神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是神經(jīng)管閉合的關(guān)鍵細(xì)胞,覆蓋在神經(jīng)管表面,其增殖、分化及遷移是神經(jīng)管正常閉合的關(guān)鍵,其異常的增值分化會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷,它具有自我更新能力及分化成多種細(xì)胞的能力,可分化為各種神經(jīng)細(xì)胞。在各種調(diào)節(jié)通路中,Notch信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖分化及胚胎發(fā)育起著精密而復(fù)雜的調(diào)控作用,Notchl是Notch蛋白家族中的重要分子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,Notchl信號(hào)通路依靠γ內(nèi)分泌酶的作用被激活。全反式維甲酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA)在體內(nèi)是維A酸的正常代謝產(chǎn)物,是胚胎發(fā)育的重要因素,而研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量全反式維甲酸導(dǎo)致NTDs的發(fā)生,但其具體的分子機(jī)制未研究清楚。本研究,從細(xì)胞學(xué)水平研究Notchl在全反式維甲酸處理過(guò)的NSCs中的作用,探討Notchl對(duì)NSCs增殖分化的調(diào)節(jié)作用,揭示全反式維甲酸導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷的分子機(jī)制,從而為神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用及臨床預(yù)防神經(jīng)管缺陷提供新的方向。目的通過(guò)利用ATRA處理神經(jīng)干細(xì)胞,檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞標(biāo)記物及Notchl的表達(dá),研究Notchl及ATRA與神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用,探究Notchl在全反式維甲酸誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞分化中的作用,從而揭示其對(duì)神經(jīng)管發(fā)育的影響。方法1.原代神經(jīng)干細(xì)胞的提取將C57/BL6小鼠按照雌雄2:1的比例(雌鼠2只,雄鼠1只)合籠,第二天早8點(diǎn)檢查雌鼠有無(wú)陰栓,見(jiàn)栓后記為孕0.5天,取孕18.5胎鼠的大腦提取原代神經(jīng)干細(xì)胞。2.免疫熒光用含有10%的胎牛血清的分化培養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,然后免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及分化產(chǎn)生的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞,并檢測(cè)Notch1在上述細(xì)胞的中的分布。3.Western blotting3.1 Western blotting檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞中Notch1,神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物-巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元標(biāo)記物-神經(jīng)絲蛋白(NF)、星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物-神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物-半乳糖腦苷脂(GALC)分別在普通分化培養(yǎng)基(對(duì)照組)和1 μ mol/LATRA(實(shí)驗(yàn)組)中1,3,5,7天時(shí)的含量。3.2將神經(jīng)干細(xì)胞分為四組:A組:普通分化培養(yǎng)基,B組:普通分化培養(yǎng)基+DMSO組,C組:普通分化培養(yǎng)基+DMSO+25μMol γ-內(nèi)分泌酶抑制劑,D組:普通分化培養(yǎng)基+DMSO+50μMol γ-內(nèi)分泌酶抑制劑,然后用Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)各組Notch1含量。結(jié)果1.原代神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)1天時(shí),可見(jiàn)多個(gè)神經(jīng)球形成。分化3天時(shí),神經(jīng)球形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變,部分神經(jīng)干細(xì)胞從神經(jīng)球中游離出來(lái)。分化5天時(shí),神經(jīng)球明顯減小,伸出條索狀突起。分化7天時(shí),可見(jiàn)多種不同形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞,一種是胞體成圓形或橢圓形,伸出一條細(xì)長(zhǎng)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞,一種是胞體成多角型并伸出多條較粗的突起,可見(jiàn)明顯胞核的星型膠質(zhì)樣細(xì)胞,一種是胞體較小,伸出短小突起的少突膠質(zhì)樣細(xì)胞。2.免疫熒光鑒定分化培養(yǎng)基中神經(jīng)干細(xì)胞中Nestin、NF、GFAP及GALC成陽(yáng)性,且在神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上及細(xì)胞質(zhì)中有Notch1存在。3.ATRA處理神經(jīng)干細(xì)胞前后Notch1及NF、GFAP、GALC的含量變化從1天到5天,對(duì)照組的神經(jīng)干細(xì)胞中Notch1,第5天相對(duì)第1天有明顯的增加(P＜0.05),從第5天到第7天,Notch1明顯下降(P＜0.05),NF在第3天相對(duì)第1天有明顯增加(P＜0.05),第5相對(duì)第3天有明顯下降(P＜0.05),GFAP與GALC含量在1,3天無(wú)明顯變化,GFAP第5天明顯相對(duì)第1天明顯下降(P＜0.05),而第7天含量相比第5天明顯增加(P＜0.05)。GALC第5天明顯相對(duì)第1天明顯下降,而第7天含量相比第5天明顯增加(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)干細(xì)胞,1天到3天時(shí),Notch1未見(jiàn)明顯變化,第7天Notch1含量較第1天明顯下降(P＜0.05),而NF第7天含量相比第1天明顯增加(P＜0.05),第5天與第1天相比明顯增加(P＜0.05),GFAP第7天含量相比第1天明顯增加(P＜0.05),第5天與第1天相比明顯增加(P＜0.05),GALC第7天含量相比第1天明顯增加(P＜0.05),第5天與第1天相比明顯增加(P＜0.05)。4.γ內(nèi)分泌酶抑制劑處理神經(jīng)干細(xì)胞后Notch1含量變化C組的神經(jīng)干細(xì)胞Notch1的胞內(nèi)段(分子量120KD)表達(dá)量較A組明顯降低(P＜0.05),D組的神經(jīng)干細(xì)胞Notch1的胞內(nèi)段(分子量120KD)表達(dá)量較A組明顯降低(P＜0.05),C組的神經(jīng)干細(xì)胞Notch1的全長(zhǎng)(分子量300KD)表達(dá)量較A組明顯增加(P＜0.05),D組的神經(jīng)干細(xì)胞Notch1的胞內(nèi)段(分子量300KD)表達(dá)量較A組明顯(P＜0.05)。結(jié)論1.Notch1抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化。2.ATRA處理神經(jīng)干細(xì)胞后,Notch1含量下降,神經(jīng)干細(xì)胞分化增強(qiáng),ATRA促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。3.γ內(nèi)分泌酶抑制劑作用于神經(jīng)干細(xì)胞,NICD含量減少,抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化的能力下降。我們推測(cè)ATRA主要通過(guò)抑制γ內(nèi)分泌酶的作用而抑制Notch1信號(hào)通路,從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。為我們對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞在將來(lái)的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)并且給我們預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷提供了新的治療窗口。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

圖２神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞（倒置顯微鏡，Ｘ４０）??Ａ．神經(jīng)元樣細(xì)胞，胞體成圓形或橢圓形，伸出一條細(xì)長(zhǎng)突起．Ｂ．星型膠質(zhì)樣胞，胞體成多角型并伸出多條較粗的突起，可見(jiàn)明顯胞核．Ｃ．少突膠質(zhì)樣細(xì)胞，體較小，伸出短小突起。??圖３神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞（熒光顯微鏡，Ｘ２００）??

?山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???Ａ．神經(jīng)元細(xì)胞（紅色，ＮＦ）?Ｂ．星型膠質(zhì)細(xì)胞（紅色，ＧＦＡＰ）?Ｃ．少突膠質(zhì)細(xì)??胞（紅色ＧＡＬＣ）??Ａ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?Ｎｅｓｔｉｎ?Ｂ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?ＮＦ?Ｃ．Ｎｏｔｃｈｌ?＋?ＧＦＡＰ?Ｄ．Ｎｏｔｃｈｌ＋ＧＡＬＣ??

圖６?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測(cè)經(jīng)ＡＴＲＡ處理的神經(jīng)干細(xì)胞在１，３，５，７天時(shí)Ｎｏｔｃｈ?１、??ＮＦＦＡＰ、ＧＡＬＣ?的含量??圖Ａ，?Ｎｏｔｃｈｌ在１天到３天時(shí)，未見(jiàn)明顯變化，第７天含量較第１天明顯下??降（尸＜０．０００１），??圖Ｂ．?ＮＦ第７天含量相比第１天明顯增加（Ｐ０．０００１），第５天與第１天相比明顯??增力ｎ（Ｐ＜０．０００１），圖Ｃ．?ＧＦＡＰ第７天含量相比第１天明顯增加（Ｐ＜０．０００１），第５??天與第１天相比明顯增加（ｐ＝〇．〇〇〇ｌ?），圖Ｄ．ＧＡＬＣ第７天含量相比第１天明顯增??加（Ｐ＝０．０００１），第５天與第１天相比明顯增加（ＺＭＸ０００７）。??Ｎ〇ｔｃｈｉ（３〇〇ｋｄ）?????．?＇＊１＾．１?ｒｎ＇ｗｍ■…??Ｎ〇ｔｃｈｉ（ｉ？〇ｋｄ）??Ｔｕｔ＞ｕ＂ｎ?￣一??ｒｓｉｖ＞ｕ．Ｍ（?１?＾ＯＫｉｉ）?ＨＭ?２?Ｉ?￣￣￣￣?Ｉ??ｒｓｉ〇ｉｔ?ｉ“３〇（》ｋ？ｉ》■?ｉ?｜?■?—?—?＊?｜??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2841225