發(fā)布時(shí)間：2020-10-11 23:51

　　 研究目的和意義1.研究miRNA-182-5p和TLR4在OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)情況以及兩者之間的調(diào)節(jié)關(guān)系;2.研究在OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中miRNA-182-5p對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用以及是否通過(guò)TLR4的介導(dǎo);3.研究miRNA-182-5p是否對(duì)腦缺血再灌注大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng);4.研究miRNA-182-5p對(duì)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是否是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng);研究方法1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-182-5p的模擬物及抑制劑,經(jīng)OGD處理后,RT-PCR及Western Blot檢測(cè)miRNA-182-5p及TLR4的表達(dá);BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-182-5p的模擬物后經(jīng)OGD處理,RT-PCR及ELISA檢測(cè)促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1β的水平;BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siTLR4后經(jīng)OGD處理,western blot檢測(cè)TLR4的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1β的水平;另外BV2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-182-5p的模擬物及TLR4(ORF),Western Blot檢測(cè)TLR4的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-11β的水平。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):連續(xù)三天靜脈注射miRNA-182-5p模擬物,制作MCAO模型模擬腦缺血再灌注,TTC染色觀察缺血面積,mNSS評(píng)分及foot-fault test檢測(cè)神經(jīng)功能;取缺血灶半暗帶腦組織提取RNA及蛋白,RT-PCR及ELISA檢測(cè)促炎因子TNF-a,IL-6 and IL-1 β 的水平,RT-PCR及western blot檢測(cè)TLR4的表達(dá)。研究結(jié)果1.在OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中miRNA-182-5p水平下調(diào),TLR4表達(dá)上調(diào)BV2細(xì)胞經(jīng)OGD處理,在0,3,6和12小時(shí)檢測(cè)MicroRNA-182-5p水平發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),而TLR4 mRNA和蛋白水平隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。2.在OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中MiRNA-182-5p調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)BV2細(xì)胞過(guò)表達(dá)及敲減miRNA-182-5p,與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn),TLR4 mRNA和蛋白相對(duì)水平降低及升高;經(jīng)OGD處理后,與NC組比較發(fā)現(xiàn),TLR4mRNA和蛋白相對(duì)水平降低及升高。3.TLR4是miRNA-182-5p的直接靶點(diǎn)HEK293和BV2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染TLR4 3'-UTR野生型或突變型luciferase質(zhì)粒及miRNA-182-5p mimics,較NC組,TLR4 3'-UTR野生型熒光素酶活性較弱(p0.05),而TLR4 3'-UTR突變型熒光素酶活性與NC組無(wú)明顯差別。4.miRNA-182-5p抑制OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)BV2細(xì)胞過(guò)表達(dá)miRNA-182-5p且經(jīng)OGD處理,與對(duì)照組比較,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA及蛋白相對(duì)值均明顯降低。5.miRNA-182-5p通過(guò)TLR4介導(dǎo)抑制OGD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siTLR4且經(jīng)OGD處理,與NC組比較,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA相對(duì)值明顯降低;而同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-182-5p及TLR4(ORF)質(zhì)粒且經(jīng)OGD處理后,與NC組比較,TNF-a,IL-6 and IL-1β的mRNA相對(duì)值明顯升高。6.miRNA-182-5p抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用與NC組比較,miRNA-182-5p處理組腦缺血面積明顯減小;mNSS及foot-fault test行為學(xué)評(píng)分顯示,較NC組,miRNA-182-5p處理組從第7天開始有所改善,在第14、21及28天改變明顯;較NC組,miRNA-182-5p處理組Ibal、TLR4陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。7.miRNA-182-5p抑制TLR4的表達(dá)來(lái)減輕腦缺血再灌注大鼠的炎癥反應(yīng)與NC組比較,miRNA-182-5p處理組TNF-a,IL-6 and IL-1β 的mRNA及蛋白表達(dá)相對(duì)值均顯著降低,TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)相對(duì)值降低。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

??而ＴＬＲ４的轉(zhuǎn)錄與翻譯的水平均明顯升高（圖１－１Ｂ、Ｃ）。??ＡＢＣ?丨丨丨丨！?一：｜??ｓｌｉｕｉ?ｉ：Ｕｉ?Ｑ??０３８?１２?０３６?１２?０３６?１２??ＯＧＤ｛ｈ）?〇ＧＤ?（ｈ）??圖１－１?ＯＧＤ處理不同時(shí)間后小膠質(zhì)細(xì)胞中ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ＴＬＲ４?ｍＲＮＡ和蛋白相對(duì)表達(dá)量。Ａ，??ｍｉＲ－１８２－５ｐ的相對(duì)表達(dá)量。Ｂ

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ｍｉＲ－１８２－５ｐ?后經(jīng)?０ＧＤ?處理?ＢＶ２?細(xì)胞，ＲＴ－ＰＣＲ?檢測(cè)?ＴＮＦ－ａ，ＩＬ－６?ａｎｄ?ＩＬ－１３?的??轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示較空白對(duì)照組，０ＧＤ處理后促炎因子水平顯著升高，而在轉(zhuǎn)??染ｎｉｉＲ－１８２－５ｐ后促炎因子仍處于較低水平（圖２－２Ａ）；進(jìn)一步我們通過(guò)ＥＬＩＳＡ??檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清促炎因子蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示ｍｉＲ－１８２－５ｐ組促炎因子蛋??白水平明顯低于０ＧＤ對(duì)照組和ＮＣ組（圖２－２Ｂ、Ｃ和Ｄ），以上數(shù)據(jù)說(shuō)明ｍｉＲ－１８２－??５ｐ抑制０ＧＤ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。??Ａ?Ｂ??１５１?■ＩＮＦａ?勹?＊??〇，?－ｇ?ＪＬＡ?Ｉ?Ｉ?ＩＬ－１Ｐ?＾４００－?ＪＸＬ?ＪＴ?１??ｉｉ－?？?ｋ?Ｉ?■??ｉ：Ｕｕ??ＯＧＤ?一?＋?＋＋?－?＋?＋＋?—?＋?＋?＋?ＯＧＤ?一?＋?＋?＋??ＮＣ?一?一＋—??＋——?—?＋?—?ＮＣ?一?一?＋?—??ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—?一一＋?一一一?＋?一一—＋?ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—一一?＋??Ｃ?Ｄ?＊??１２０－１?１００－ｉ?＊?，?，??！：ｉｒ?ｈｌｉ，??ｉｌｌＩｔ?ＪｔｌＸｌ??ＯＧＤ?一?＋?＋?＋?ＯＧＤ?－?＋?＋?＋??ＮＣ?—?一?＋?—?ＮＣ?一?一?＋?—??ｍｉＲ－１８２－５ｐ?－一一?＋?ｍｉＲ－１８２－５ｐ?—?一一?＋??圖２－２?ｍｉＲ－１８２－５ｐ抑制０ＧＤ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Ａ，?ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－１８２－５ｐ??或?ＮＣ?后經(jīng)?０ＧＤ?誘導(dǎo)?ＴＮＦ－ａ
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