背景與目的:膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤。膠質(zhì)母細胞瘤是膠質(zhì)瘤最常見也是最致命的亞型。因其異質(zhì)性強、生長速度快等特點,患者中位生存期較低。外科方法切除腫瘤輔以術(shù)后標準化放療和化療是目前治療惡性腦膠質(zhì)瘤的公認治療方案。替莫唑胺是二代口服烷化劑,由于其對惡性膠質(zhì)瘤殺傷性強等特點,被用作治療膠質(zhì)瘤的標準化療藥物。但替莫唑胺耐藥已成為臨床棘手和亟待解決的問題,且化療耐藥機理仍有待深入了解。外泌體是目前定義及功能最為明確的胞外囊泡,因其在細胞間通訊過程中的信使作用而備受關注。外泌體可包裹RNA和蛋白等至受體細胞,對受體細胞生物學功能發(fā)揮一定調(diào)控作用。其中研究最多的目標是外泌體中miRNA和lncRNA。在本研究中,我們以miR-1238為研究目標,擬探究外泌體miR-1238調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關機制。材料與方法:1.分步誘導法構(gòu)建替莫唑胺耐藥細胞系。CCK-8、細胞平板克隆驗證耐藥細胞耐藥程度。2.應用qRT-PCR檢測miR-1238在腫瘤細胞、腫瘤標本及血清標本中差異表達情況。3.超速離心法提取細胞外泌體。掃描電鏡、納米示蹤技術(shù)和western blot鑒定外泌體。4.外泌體孵育模型處理敏感細胞。CCK-8、細胞平板克隆、流式細胞法檢測受體細胞替莫唑胺耐藥表型改變5.應用軟件預測、生物信息學分析、western blot和雙熒光素酶報告基因分析miR-1238潛在靶基因。6.回復實驗驗證miR-1238/CAV1信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥。7.裸鼠體內(nèi)驗證外泌體miR-1238調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥作用。研究結(jié)果:1.成功構(gòu)建出兩株耐藥細胞系:U251r和N3r。耐藥指數(shù)約為相應敏感細胞的6-8倍。miR-1238在復發(fā)GBM樣本和TMZ耐藥細胞系中高表達。2.胞外miR-1238表達水平越高,細胞TMZ耐藥性越強。復發(fā)GBM患者血清中miR-1238表達水平較原發(fā)GBM患者高。3.耐藥細胞源性外泌體可包裹miR-1238至敏感細胞。4.耐藥細胞外泌體可顯著增強敏感細胞耐藥性,且miR-1238起關鍵作用。5.CAV1是miR-1238潛在靶基因。6.miR-1238/CAV1信號通路調(diào)控GBM細胞耐藥性。7.耐藥細胞源性外泌體介導miR-1238體內(nèi)增強GBM對TMZ耐藥性。研究結(jié)論:1.血清miR-1238水平可預測膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療敏感性。2.耐藥細胞源性外泌體包裹miR-1238至敏感細胞可增強受體細胞耐藥性。3.miR-1238通過靶向CAV1調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺耐藥。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

養(yǎng)上清中 miR-1238 表達水平顯著高于敏感細胞培養(yǎng)上清（Condition medium, CM）（圖 2C）；超速離心法收集兩種細胞培養(yǎng)上清中外泌體（Exosomes），qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)耐藥細胞外泌體中miR-1238表達水平顯著高于敏感細胞外泌體（圖2D）。以上實驗結(jié)果提示，GBM 細胞外泌體中 miR-1238 水平越高，其耐藥性越強；GBM 患者外周動脈血中 miR-1238 水平可作為評估患者化療敏感性的指標。

圖 4：耐藥細胞源性外泌體包裹 miR-1238 至敏感細胞增強其耐藥性（A）：qRT-PCR 驗證 miR-1238 在 U251r 和 N3r 細胞中敲低效率。（B）：qRT-PCR確認 miR-1238 低表達外泌體（1238-down Exo）中 miR-1238 表達水平。（C 和 D）：CCK-8 實驗驗證不同類型外泌體對敏感細胞耐藥性調(diào)控作用。（E）：平板克隆實驗驗證不同類型外泌體對敏感細胞耐藥性調(diào)控作用。（F）：流式細胞法驗證不同類型外泌體對敏感細胞受 TMZ 處理后凋亡水平調(diào)控作用。（G）：Western blot 檢測不同類型外泌體孵育敏感細胞后，細胞內(nèi) cleaved caspase-3 表達水平改變。*p < 0.05, **p< 0.01。5. CAV1 是 miR-1238 的直接靶點為探究外泌體 miR-1238 促進受體細胞耐藥的潛在機制，我們通過TargetScan，miWalk 和 RNA22 預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn) CAV1 是 miR-1238 的潛在靶點（圖5A）。 CAV1 是 Caveolin 家族中研究最多的成員，既可作為腫瘤抑制因子，也可

敲低外泌體中 miR-1238 后，凋亡率則顯著升高（圖7D）。腫瘤形成后 27 天，我們收集了小鼠外周動脈血，并檢測分析了小鼠血清中 miR-1238 表達水平。結(jié)果提示腫瘤體積越大，小鼠動脈血血清中 miR-1238表達水平也越高，小鼠對 TMZ 耐受性更強（圖 8E）。以上結(jié)果證實耐藥細胞源性外泌體可傳遞 miR-1238 至敏感細胞促進受體細胞耐藥；同時也證實了我們先前的結(jié)論，即血清外泌體內(nèi) miR-1238 水平可預測腫瘤化療敏感性。

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本文編號：2834095