癲癇是一種常見的神經性疾病,以反復的、自發(fā)的癲癇發(fā)作為臨床特征。癲癇發(fā)作是由大腦皮層神經元的超同步異常放電導致腦功能暫時性紊亂的一種現象。癲癇具有很高的發(fā)病率和致死率,然而癲癇的病因和發(fā)病機理還不是很清楚�？赡軐е掳d癇的病因有很多,比如遺傳因素、后天獲得因素以及刺激因素等等。單基因突變可以導致特發(fā)性癲癇,而這些單基因中有很大一部分是編碼離子通道的基因,其中包括電壓門控型的鉀離子通道、鈉離子通道和鈣離子通道,還有煙堿型乙酰膽堿受體和GABAA型受體等等。之前,我們實驗室報道了KCNMA1基因上的一個突變p.D434G可以導致全身性癲癇和陣發(fā)性運動障礙(GEPD),第一次把KCNMA1基因和癲癇關聯了起來。KCNMA1基因編碼的BK通道是一種可以同時被鈣離子和電壓激活的大電導鉀離子通道。BK通道廣泛表達于機體的各種組織和細胞中,參與了許多重要的生理過程,比如神經遞質的釋放,平滑肌的收縮和耳蝸毛細胞的調諧等等。BK通道的電壓敏感器位于S4跨膜片段,鈣離子敏感位點存在于胞質內的兩個RCK結構域中。p.D434G突變導致GEPD的分子機制是,它通過提高BK通道的鈣離子敏感性進而增強了通道的激活特性。本次研究中,我們一共收集到了四個KCNMA1基因的突變,c.2984AG(p.N995S)、c.3476AG(p.N1159S)、c.1967AC(p.E656A)和c.1554GT(p.K518N),它們分別是從五名相互獨立的癲癇患者中被鑒定出來的,這些病人沒有陣發(fā)性運動障礙。其中c.2984AG(p.N995S)這個突變分別以新發(fā)突變(de novo mutation)的形式發(fā)生在兩個獨立的癲癇患者中,從遺傳學的角度而言,強力支持該突變和癲癇存在關聯。然而,突變基因的功能研究對于判斷一個突變到底是否能夠致病尤為重要,所以我們把這些突變分別引入到BK通道的表達質粒上,然后轉染到HEK293細胞中進行表達,運用膜片鉗技術,通過記錄宏觀電流和單通道電流來研究這些突變型通道的電生理性質,從而揭示BK突變導致癲癇的分子機制。結果表明,在10μM的胞內鈣離子濃度下,p.N995S突變可以使BK通道的激活GV曲線朝著負電壓的方向偏移59 mV,但是另外三個突變對BK通道的功能并沒有影響。而且,在BK通道的β4亞基存在的情況下,p.N995S突變依然可以使BK通道的激活GV曲線朝著負電壓的方向偏移71 mV。這說明了p.N995S這個突變應該是通過增強BK通道的激活特性引發(fā)癲癇,而另外三個突變只是良性的變異,和癲癇之間應該沒有什么關聯�？紤]到之前的p.D434G突變是通過增加通道的鈣離子敏感性來增強通道的激活特性,并且p.N995S突變位于通道的RCK2結構域,所以我們接下來對p.N995S突變型通道的鈣離子敏感性進行了研究。結果表明,p.N995S突變對BK通道激活的增強程度在不同的鈣離子濃度下是類似的,并且當通道的鈣離子結合位點被突變掉之后(p.2D2A/p.5D5N),p.N995S依然可以增強通道的激活特性。這些結果說明了p.N995S突變并不影響B(tài)K通道的鈣離子敏感性。之后,我們通過分析單通道電流,發(fā)現p.N995S突變可以增加BK通道的單通道開放機率和單通道開放駐留時間。從我們的實驗數據推測出,p.N995S可以增強BK通道的電壓激活和孔道開關之間的變構耦合作用,并且可以穩(wěn)定通道的開放態(tài)構象。另外,BK通道的選擇性抑制劑蕈青霉素對野生型和p.N995S突變型通道皆有阻斷作用,這個結果指出了BK通道的抑制劑可以被用來設計藥物,治療那些由BK通道活性異常增強而導致的癲癇。總結,我們在BK通道上鑒定出了可以引起癲癇的第一個新發(fā)突變p.N995S。與之前的p.D434G突變相比,攜帶p.N995S突變的患者只表現出癲癇,并沒有陣發(fā)性運動障礙。雖然這兩個突變都可以增強BK通道的激活特性,但是卻有著不同的分子機制。p.D434G突變是通過增加鈣離子敏感性來增強通道的激活特性,而p.N995S突變是通過增加單通道開放機率和單通道開放駐留時間來增強通道的激活特性,并且p.N995S突變不影響通道的鈣離子敏感性。我們的研究結果進一步驗證了BK通道和癲癇的相關性,為癲癇的遺傳診斷提供了理論依據,并且指出了電生理研究對于判斷通道突變是否致病的重要性。我們建議,可以把BK通道作為藥物靶點,從BK通道的抑制劑中來篩選設計抗癲癇藥物,另外可以把p.N995S突變當作工具來研究BK通道的結構和門控機制。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

圖 1-1 離子通道的卡通示意圖 （圖片來源：http://umdberg.pbworks.com/Diffusion-through-an-ion-channel）Figure 1-1 Cartoon of ion channel子通道的研究歷史 18 世紀 80 年代，生物電磁學的先驅，意大利生物學家 L. Galvani電刺激已經死亡的蛙腿，能夠使得蛙腿產生抽搐，這一現象被認

中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 離子通道也被他們克隆了出來。自此之后，越來越多的來，后面隨著免疫技術、蛋白純化技術和基因技術等分再后來的晶體 X 射線衍射、核磁共振、冷凍電鏡等成離子通道的研究更是從間接的功能研究逐漸過渡到了直克菲勒大學的 R. MacKinnon 等人利用晶體 X 射線衍射霉菌里面的一種鉀離子通道 KcsA 的三維結構[28]，如圖

16圖 1-3 電壓門控型離子通道超級家族 （圖片來源：tp://www.guidetoimmunopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward?type=IFigure 1-3 The voltage-gated ion channel superfamily配體門控型離子通道又稱為離子通道型受體或者化學門控型離子通道，是通過與特定化學物質結合來改變門開放狀態(tài)的離子通道。這類離子通道都典型的結構域，一個是跨膜結構域，用來形成離子孔道，另一個是配體結變構結合位點），用來相應特定的化學配體，從而控制離子通道的開放與門控型離子通道依據其響應配體的不同，可以細分為三類：半胱氨酸環(huán)受

【參考文獻】

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1 侯盼盼;BK通道的動態(tài)鈣離子敏感性以及α/β亞基間相互作用機制的研究[D];華中科技大學;2014年

本文編號：2821825