背景神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,可起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部位,其最常見的原發(fā)部位是交感神經(jīng)鏈和腎上腺髓質(zhì),但也可發(fā)生于頸部、胸部、腹部以及盆腔的神經(jīng)組織等部位。將近一半的NB發(fā)生于2歲以內(nèi)的嬰幼兒,少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化成良性腫瘤甚至自然消退,但大部分治療仍存在較大難度,且預(yù)后不良。目前NB的治療方式仍以手術(shù)、化療和放療為主,但由于放療、化療等治療手段會對人體產(chǎn)生嚴重的毒副作用,因此迫切需要尋找新的安全有效的藥物。研究報道五味子具有重要的抗癌功能,五味子醇甲作為五味子木脂素的主要成分,其抗癌效果也被多次報道,但具體機制尚不明確。由于五味子醇甲屬于小分子脂溶性物質(zhì),可能會通過血腦屏障,因而該藥可為神經(jīng)疾病的治療提供支持。本次實驗首次選用五味子醇甲處理神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞,探索該藥是否能夠抑制SH-SY5Y細胞的增殖和遷移,并探討其可能的機制,所得結(jié)果可能為NB的臨床治療提供新的研究靶點。目的通過探索五味子醇甲抑制神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞增殖及遷移的可能機制,為用五味子醇甲作為臨床藥物治療NB提供新的理論支持。方法1.神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中分別加入不同濃度的五味子醇甲,經(jīng)不同時間處理后用MTT檢測細胞活性,確定五味子醇甲適宜作用時間和濃度。2.SH-SY5Y細胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過DAPI染色和流式技術(shù)檢測細胞是否發(fā)生凋亡。根據(jù)實驗結(jié)果,選用qRT-RCR和Western Blot實驗檢測Bcl-2、Bcl-xl、Bax和p-AMPK等基因mRNA和蛋白的表達水平。3.SH-SY5Y細胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過流式細胞儀進行活細胞周期檢測。并根據(jù)實驗現(xiàn)象,通過qRT-RCR和Western Blot實驗檢測cyclinD1、CDK4和P21等基因mRNA和蛋白的表達水平。4.SH-SY5Y細胞加入不同濃度的五味子醇甲處理后通過劃痕實驗檢測細胞遷移程度;并將相同濃度的五味子醇甲加至200個/mL濃度的細胞中,連續(xù)培養(yǎng)多天后觀察細胞集落克隆結(jié)果。根據(jù)此實驗現(xiàn)象,分別用qRT-RCR和Western Blot實驗檢測MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果1.SH-SY5Y細胞經(jīng)不同濃度的五味子醇甲分別處理,經(jīng)不同時間處理后,MTT結(jié)果顯示:與空白對照組相比,五味子醇甲處理組細胞隨著藥物濃度增加和處理時間的延長,增殖抑制率明顯增加,與藥物作用時間和劑量成正相關(guān)。2.DAPI染色和流式凋亡檢測結(jié)果顯示與對照組相比,五味子醇甲處理組細胞凋亡數(shù)目增多,且核凋亡現(xiàn)象明顯。qRT-RCR結(jié)果顯示:與對照組相比Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表達水平呈下降趨勢;Western Blot結(jié)果顯示Bcl-2的蛋白表達水平降低,而Bax和p-AMPK的蛋白表達水平增加。3.流式技術(shù)檢測各處理組細胞周期分布情況,結(jié)果顯示:與對照組相比,隨藥物濃度增加,G2/M期細胞比例增加,G1期比例減少,即發(fā)生了G2/M期周期阻滯。qRT-RCR和Western Blot結(jié)果顯示:與對照組相比cyclinD1、CDK4的mRNA和蛋白表達水平均降低,與五味子醇甲劑量呈負相關(guān),但P21的蛋白表達水平升高,與藥物劑量呈正相關(guān)。4.劃痕實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,五味子醇甲處理組細胞遷移能力明顯減弱;集落克隆實驗結(jié)果顯示:藥物處理組細胞克隆數(shù)目及大小與對照組相比明顯減少,與藥物濃度呈負相關(guān)。qRT-RCR和Western Blot結(jié)果顯示:MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達水平均降低,與五味子醇甲劑量呈負相關(guān)。結(jié)論1.五味子醇甲對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的增殖及遷移具有抑制作用,且呈時間和劑量依賴性。2.五味子醇甲可能通過影響cyclinD1、CDK4和P21等基因的表達阻滯細胞周期進程,也可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因的表達促進了SH-SY5Y細胞的凋亡,發(fā)揮抗增殖作用。3.五味子醇甲抑制SH-SY5Y細胞的遷移可能是通過抑制MMP9、HIF-1α和VEGF等基因的表達實現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖3-8：細胞劃痕實驗后，連續(xù)觀察3天，分別在24 h、48 h和72 h進行拍照。圖A為鏡下拍攝圖為統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。*p<0.05，**p<0.01。移相關(guān)的基因mRNA和蛋白的表達水平步明確五味子醇甲抑制SH-SY5Y細胞遷移可能機制，細胞分別、5 μM、10 μM、20 μM）的五味子醇甲培養(yǎng)72 h后，qRT-PCR和細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）VEGF）等基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與對照用組細胞中MMP9、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達水平依賴性。p<0.05，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 竇志華;安莉萍;陳敏;繆應(yīng)祥;喬進;陳霞;馮艷;;一測多評法同時測定五味子中6種木脂素類成分含量[J];中國藥學(xué)雜志;2014年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 談衛(wèi)強;青蒿素抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖的機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

本文編號：2821123