發(fā)布時間：2020-09-07 14:55

　　 目的腦膠質瘤是成人最具侵襲性的惡性腦瘤,盡管傳統(tǒng)治療方式取得了一些進展,其難治性仍是臨床困擾的問題,大量臨床前實驗及臨床實驗證實,免疫療法是一種能夠靶向殺傷腫瘤組織的特異性治療手段。以表皮生長因子受體III(Epidermal growth factor receptor type III,EGFRvⅢ)為靶點的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)T細胞過繼免疫療法是治療GBM的高效手段。與EGFR完整結構想比較,EGFRvⅢ的第二、第三、第四、第五、第六、第七個外顯子被刪除,導致801個堿基對的缺席,從而形成了新的甘氨酸密碼子。在被翻譯之后,胞外區(qū)6~273氨基酸被一個甘氨酸殘基替代,最終形成了EGFRvⅢ,其特點是在正常組織中不表達,僅在腫瘤細胞中出現(xiàn)~([1]),而且是一種在包括腦膠質瘤在內的多數(shù)腫瘤中表達率極高的腫瘤特異性抗原,與腫瘤的許多惡性表型的出現(xiàn)密不可分,因此可當做合適的腫瘤治療靶標,目前已經(jīng)成為備受矚目的腫瘤靶向治療的分子靶點。EGFRvⅢ作為一個分子靶點,為膠質瘤的靶向治療提供了新思路,本論文中構建的穩(wěn)定表達EGFRvⅢ的U87細胞株,為膠質瘤的靶向治療提供研究基礎。方法首先EGFRvⅢ cDNA(2832bp)克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的XbaI和NotI位點,引物中添加His6標簽,測序鑒定;用磷酸鈣沉淀法將含目的基因的質粒pCDH-CMV-EGFRvⅢ-EF1-puro與慢病毒包裝質粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白質粒pVSV-G三質粒共轉染293T細胞。過濾、濃縮包裝好的病毒后,利用稀釋計數(shù)法測定病毒滴度。制備好的慢病毒感染U87細胞,嘌呤霉素篩選、有限稀釋克隆培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達細胞株。Western blot采用人EGFRvⅢ單抗、His6單抗檢測篩選的細胞株,流式細胞術檢測EGFRvⅢ在U87細胞表面的表達。結果重組質粒pCDH-EGFRvⅢ經(jīng)XbaI和NotI雙酶切、1%瓊脂糖凝膠電泳,產(chǎn)物與預期目的基因EGFRvⅢ cDNA(2832bp)大小一致;Western blot鑒定6株U87-vIII均表達EGFRvⅢ蛋白(145kd)和His6(145kd);流式細胞術檢測2株U87-vIII細胞株(U87-vIII-2,U87-vIII-4)表面均表達EGFRvⅢ蛋白(分別為93.1%和96.9%)。結論穩(wěn)定表達EGFRvⅢ的U87細胞株被成功建立,為膠質瘤靶向治療研究提供了基礎。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

結果H-EGFRvIII 的檢測-EGFRvIII 經(jīng) XbaI 和 NotI 雙酶切，酶切產(chǎn)物用 1%瓊脂p和8kbp的兩個片段，預期目的基因EGFRvIII cDNA分子-CMV-MCS-EF1-puro 的分子量為 7384dp，可見兩個片段基因和載體大小一致（圖 2.1）。DNA 測序分析結果與 N 列 一 致 ， 雙 酶 切 和 測 序 分 析 結 果 表 明 V-EGFRvIII-EF1-puro 重組成功。

圖 2.2 免疫熒光檢測 pCDH-CMV-EGFRvIII-EF1-puro 瞬時轉染 293T 細胞的表達1 2 34 5圖 2.3 病毒滴定測定 顯微鏡觀察部分不同稀釋濃度的細胞

224 5圖 2.3 病毒滴定測定 顯微鏡觀察部分不同稀釋濃度的細胞病毒稀釋濃度 1～5 依次為 10-1，10-2，10-3，10-5，10-73 Western blot 檢測 EGFRvIII 表達鑒定結果LV-EGFRvIII 感染 U87 細胞，用嘌呤霉素篩選，抗性克隆擴大培養(yǎng)，獲得 6株細胞：U87-vIII 1～6，提取感染之后的細胞的蛋白，用 Western blot 檢測目的

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 孟凡榮;陳琛;萬海粟;周清華;;慢病毒載體及其研究進展[J];中國肺癌雜志;2014年12期

2 張曼;孫秀萍;宋銘晶;;慢病毒載體用于轉基因技術的研究進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2014年10期

本文編號：2813491