發(fā)布時間：2020-08-26 17:39

【摘要】：前言癲癇是一種大腦神經元放電異常的復雜的神經系統(tǒng)性疾病,發(fā)病率為0.5-1%影響著世界上7000多萬病患者。癲癇具有復雜的發(fā)病機制,且其機制尚未明確。Ca~(2+)/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKII)作為Ca~(2+)/鈣調蛋白(Calmodulin,CaM)調節(jié)蛋白家族中的一個主要成員,其在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。研究表明,CaMKII磷酸化活性在不同癲癇模型中下降,我們前期研究結果表明遺傳性癲癇震顫大鼠(Tremor,TRM)海馬中磷酸化CaMKⅡ蛋白表達下調。KN93為CaMKII特異性抑制劑,可抑制CaMKII磷酸化活性。到目前為止,KN93對神經細胞的毒性作用與機制并不清楚。電壓門控鈉通道(Voltage-gated sodium channel,VGSC)是常見且重要的鈉通道類型之一,其由一個α亞基和多個β亞基(β_1-β_4)構成,α亞基具有10種不同的亞型(Na_V1.1-1.9,Nax),其中Na_V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6這4種亞型在中樞神經系統(tǒng)中大量分布。VGSC作為啟動神經元的動作電位,同時VGSC也是抗癲癇藥物的主要治療靶點。我們既往研究和他人研究表明病人癲癇腦組織和癲癇動物模型VGSC的蛋白表達上調,VGSC功能亦發(fā)生變化。同時,我們前期發(fā)現側腦室給予KN93的自發(fā)性癲癇大鼠海馬組織中磷酸化CaMKⅡ蛋白表達進一步下調,Na_V1.2蛋白表達上調,表明CaMKⅡ抑制改變VGSC的表達,可能與癲癇的發(fā)病機制或繼發(fā)表現相關。到目前為止,CaMKⅡ活性抑制對神經細胞VGSC的作用仍不清楚。絲裂原活化蛋白激酶又稱促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK或MAP激酶)是特定于氨基酸、絲氨酸和蘇氨酸的特異性蛋白激酶。MAPK參與指導細胞對多種刺激的反應,例如有絲分裂原、滲透壓、熱休克和促炎細胞因子。它們調節(jié)細胞功能,包括增殖、基因表達、分化、有絲分裂細胞存活和細胞凋亡。c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPK的重要通路靶點之一,最初鑒定為激酶結合并磷酸化c-Jun的上絲氨酸其轉錄激活結構域內的-63和Ser-73。它們屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,并控制由細胞因子、紫外線照射、熱休克和滲透壓休克等原因導致的應激反應,并在細胞凋亡途徑中起關鍵作用。研究表明哺乳動物和昆蟲的炎癥反應可通過兩種MAP激酶激酶MKK4和MKK7進行活化,并且可以通過Ser/Thr和Tyr蛋白磷酸酶使JNK失活。本研究使用磷酸化的JNK抑制劑(p-JNK抑制劑)SP600125,我們前期研究中發(fā)現TRM海馬組織p-JNK表達升高,CaMKII活性抑制后TRM海馬組織p-JNK表達進一步升高,但JNK通路如何影響KN93對神經細胞的作用并不明確。因此,本研究通過細胞培養(yǎng)、分子生物學方法揭示KN93對大鼠原代培養(yǎng)神經元和PC12的作用及其機制,明確KN93對神經細胞的毒性作用及KN93誘導的毒性作用和p-JNK通路之間的關系,旨在進一步闡明癲癇的發(fā)病機制,為癲癇離子通道特異性藥物的篩選提供初步的理論基礎和實驗依據。實驗方法1.傳代細胞(PC12細胞系)培養(yǎng)將凍存的細胞種子37℃復蘇30分鐘,倒入具有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,每6-12h觀察細胞形態(tài)。當細胞長滿培養(yǎng)皿時開始傳代,倒出培養(yǎng)皿中的細胞液,緩慢倒入預熱的無血清培養(yǎng)液清洗三次。倒入胰酶消化3-5分鐘(隨時觀察細胞狀態(tài)),消化完全后倒入有血清培養(yǎng)液終止消化,并傳至新的培養(yǎng)皿中。取長好細胞,重復細胞傳代過程,消化完全后打入2 mL有血清培養(yǎng)液,將細胞液轉移至5 mL EP管中封好,離心后取細胞沉淀與900μL牛血清馬血清混懸液和100μL凍存液吹打細胞至均勻,轉移至細胞凍存管,4℃30分鐘,-20℃2小時,-80℃梯度凍存。2.原代海馬神經元培養(yǎng)出生2天內新生Wistar大鼠幼崽,麻醉并斷頭,迅速取出大腦放入4度存放的Hank’s液中浸泡。在顯微鏡冰浴狀態(tài)下迅速解剖海馬,取用冷藏的5 mL細胞培養(yǎng)液(Hyclone DME/F-12)清洗海馬組織三次。使用1-2 mL果膠酶消化海馬組織,輕輕吹打1-2次,取出細胞懸液將剩余組織再次使用果膠酶消化,直至消化完全。將消化后細胞與海馬神經元培養(yǎng)液均勻混合并計數進行鋪板。24小時貼壁后每隔一天半數體積換液。培養(yǎng)7-9天觀察神經元狀態(tài)后做實驗。3.免疫印跡(Western Blot,WB)實驗法取出提前鋪好的六孔細胞培養(yǎng)板,每板加150μL細胞裂解液,細胞刮刀均勻刮培養(yǎng)板至細胞完全與裂解液混合,靜置30分鐘,將細胞裂解液吸取至1.5 mL EP管中,12000轉20分鐘4℃離心,將細胞膜細胞器等雜質離心至管底。轉移上清至新的1.5 mL EP管中,測蛋白濃度。按照樣品與Loading Buffer 4:1混勻后放置樣品加熱器中加熱10分鐘,使蛋白變性。制膠后進行電泳,75 V低壓電泳30分鐘后切換電壓110 V電泳1小時。Marker電泳至玻璃板底部停止電泳,取出膠。制轉膜三明治,放入冰袋,避光濕轉大分子300 mA 6個小時,小分子200 mA 90分鐘。封閉后膜孵育VGSC亞基兔源一抗抗體和凋亡相關指標一抗抗體,TBST清洗三次每次10分鐘,孵育羊抗兔二抗,TBST清洗三次每次10分鐘。1:1配置ECL發(fā)光液,進行發(fā)光。4.CCK8(Cell Counting Kit 8)細胞毒性實驗重復細胞傳代過程,在96孔板中接種細胞懸液,每孔種5000-7000個細胞(注意混勻)。細胞貼壁后,按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100的濃度梯度給藥24小時,終濃度體積為100μL。按1:10加入CCK-8試劑,在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2小時,用酶標儀測定在450 nm處的吸光值,如果吸光度值不達標每30分鐘再測一次。CCK8細胞存活率實驗通過吸光度值按照細胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%的公式進行計算。5.流式細胞術冰浴條件下,用胰酶消化細胞,終止消化后離心取細胞沉淀。取4 mL Binding buffer放入36 mL去離子水中混勻,10倍稀釋Binding buffer試劑。加900μL PBS洗細胞,將懸液轉移到1.5 mL的EP管中,1000轉離心5分鐘。離心后去除上清,加950μL Binding buffer輕輕吹打再次離心1000轉5分鐘,以上過程重復兩次,取出離心后EP管去除上清,每管保留100μL處理后的細胞懸液。除PI單染和空白對照組,每管加5μL的FITC(綠),避光染色10分鐘。每管加5μL PI(紅),注意混勻,染完后1小時內測。加300μL PBS和樣品于流式小管中,標記樣本,測量前吹打勻。染色及數據統(tǒng)計:PI表示晚期凋亡,FITC染色表示早期凋亡。Q4代表早期凋亡;Q2代表晚期壞死;Q1代表損傷,一般以Q2+Q4為主。6.免疫熒光培養(yǎng)細胞時先每皿鋪放一張細胞爬片(WBS),取培養(yǎng)好的神經元,4%多聚甲醛固定30分鐘,并用PBS清洗10分鐘三次。3%BSA封閉液封閉30分鐘,取300倍稀釋的NeuN一抗稀釋液(Abcam)50μL 4℃濕盒中孵育一夜。第二天PBS清洗10分鐘三次,100倍稀釋FITC熒光二抗(中杉金橋)50μL敷育兩小時。PBS清洗10分鐘三次后,DAPI原液染核10分鐘,再次重復清洗步驟,取出處理好的細胞爬片,用甘油封片,熒光顯微鏡拍攝NeuN與細胞核表達情況。7.統(tǒng)計分析根據Western Blot免疫印跡實驗分別將其PVDF膜成像灰度值轉換成標準化比值。使用GraphPad 7.0軟件繪制對照組,KN93加藥組,KN93與TTX共同加藥組和KN93與p-JNK共同加藥組。免疫熒光通過Image J進行統(tǒng)計計算。使用SPSS軟件評估數據的顯著性差異,統(tǒng)計方法主要為學生氏t檢驗和方差分析,數據為平均值+標準誤,P0.05認為具有統(tǒng)計學差異,P0.01認為具有顯著性統(tǒng)計學差異。結果1.KN93給藥后24小時對細胞生存率與形態(tài)學的影響利用CCK8實驗法,應用KN93按照0、0.1、0.3、1、3、10、30、100μmol的濃度梯度給藥24小時后進行濃度效應曲線測定。細胞存活率隨KN93濃度升高而下降,當KN93濃度為25μmol時,細胞存活率為50%即細胞半數致死劑量并具有統(tǒng)計學意義(n=6)。經過KN93給藥后,原代培養(yǎng)海馬神經元中通過免疫熒光染色法發(fā)現NeuN染色的陽性細胞百分比均有下降,從細胞形態(tài)學角度證明KN93能導致細胞死亡。2.KN93給藥后24小時對細胞凋亡的影響在此基礎上,通過Western Blot實驗法對凋亡相關的幾個通路蛋白進行驗證,發(fā)現Caspase-3蛋白表達增加,凋亡通路其他相關蛋白(BCL-2,Bax,Cytochrome-c)也體現出下降或升高的趨勢,證明KN93給藥后24小時激活凋亡通路,誘導細胞凋亡(n=6)。根據蛋白層面表達,對實驗組和對照組利用流式細胞術觀察細胞凋亡程度,發(fā)現25μmol KN93給藥24小時后細胞達到半數凋亡(n=6)。3.KN93給藥后24小時對VGSC的影響為了進一步了解24小時KN93給藥誘導細胞凋亡并對神經系統(tǒng)的影響,我們研究其對VGSC四個亞型Na_V1.1,Na_V1.2,Na_V1.3,Na_V1.6的作用。電壓型門控VGSC四個亞型KN93給藥處理24小時后,我們從蛋白層面發(fā)現表達變化。與對照組相比Na _V1.1與Na_V1.2兩個亞型上調,Na_V1.6亞型下調,Na _V1.3有微弱改變但不具有統(tǒng)計學意義。這一現象表明鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的抑制劑KN93給藥后24小時改變VGSC的表達。4.p-JNK信號通路參與CaMKⅡ抑制劑KN93誘導的細胞凋亡KN93給藥后24小時可作用于p-CaMKII通路,p-JNK為p-CaMKⅡ通路中的下游蛋白,我們應用CCK8實驗法分別得出p-JNK抑制劑,p-JNK抑制劑與KN93在不同濃度時間條件下對細胞存活率的影響。通過免疫熒光技術在細胞形態(tài)表達層面觀察p-JNK抑制劑對細胞凋亡的影響。利用Western Blot實驗法發(fā)現凋亡代表性蛋白Caspase-3表達下降其他與凋亡通道相關的上下游抗體蛋白也均有變化,且p-JNK抑制劑(SP600125)可抑制KN93誘導的p-JNK表達增加。5.p-JNK信號通路參與CaMKⅡ抑制劑KN93誘導的VGSC表達異常我們應用免疫印跡實驗研究CaMKⅡ抑制劑KN93在蛋白表達層面對VGSC四個亞型Na _V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na _V1.6的影響。與KN93給藥后24小時組比較,p-JNK抑制劑可以降低Na_V1.1和Na_V1.2表達,升高Na_V1.6表達。結論與研究意義首先,我們應用CCK8測試不同給藥濃度下的細胞存活率,之后應用熒光染色染色和Western Blot免疫印跡實驗法分別在細胞形態(tài)層面和蛋白表達層面觀察給藥對細胞凋亡的影響。實驗發(fā)現KN93給藥后24小時可誘導細胞凋亡,而不同VGSC亞型對KN93給藥后24小時呈現不同表達。為了進一步探究KN93給藥后24小時作用機制,應用p-JNK抑制劑驗證鈣調蛋白激酶所在通路機制。數據顯示,p-JNK抑制劑對KN93給藥后24小時導致的細胞凋亡具有逆轉作用,并對VGSC不同亞型具有不同影響,說明p-JNK可影響VGSC表達與細胞凋亡。綜上所述,我們關注KN93給藥后24小時對VGSC的影響與p-JNK抑制劑對其細胞凋亡的逆轉和作用機制。在下一步的工作中,我們進一步研究KN93給藥后24小時誘導的毒性機制。綜上,本研究揭示KN93毒性作用,初步表明p-JNK通路參與毒性作用機制,進一步揭示癲癇發(fā)病機制并為尋找抗癲癇藥物的新靶點提供理論依據。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1
【圖文】：

12圖 1 KN93 對細胞生存率與形態(tài)學的影響。(A)KN93 濃度分別為 0.3、1、3、10、30 μM 時對 PC12細胞毒性的濃度依賴性曲線；(B)原代海馬神經元 NeuN 陽性神經元在對照組和 KN93 給藥組中的表達與定位；(C)PC12 細胞系和原代培養(yǎng)神經元中對照組與 KN93 給藥組的 WB 代表條帶和統(tǒng)計圖 *代表與正常組相比， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005, ****P<0.0001

14圖 2 KN93 給藥 24h 后對細胞凋亡的影響。(A)PC12 細胞，正常組與原代培養(yǎng)神經元，正常組與 KN93 給藥組 NeuN, Caspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 代表性蛋白條帶；(B)PC12 細胞系正常組，正常組與 KN93 給藥組 NeuN, Caspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 蛋白相對灰度值，*代表與正常組相比， *P<0.05, **P<0.01；(C)原代培養(yǎng)神經元，正常組與 KN93 給藥組 NeuNCaspase-3, Bcl-2, Bax 及 Cytochrome-c 蛋白相對灰度值，*代表與正常組相比，*P<0.05, **P<0.01

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3.3 KN93 對 VGSC 的影響為了進一步明確 KN93 給藥 24h 對 VGSC 的影響，我們研究其對 VGSC 中樞神經系統(tǒng)四個亞型 NaV1.1、 NaV1.2、 NaV1.3 與 NaV1.6 的影響。如圖 3 所示，VGSC四個亞型 KN93 給藥 24h 處理后，蛋白層面發(fā)生變化。與對照組相比，NaV1.2 亞型在兩種細胞中表達上調（n=6, *P<0.05 和**P<0.01），NaV1.1、NaV1.3 和 NaV1.6 無明顯變化 。上述結果表明 KN93 給藥后 24 小時導致 VGSC 亞型的異常表達。

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3 羅放;田玉科;;鞘內注射KN93對小鼠慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛作用[A];中華醫(yī)學會疼痛學分會第七屆年會論文摘要集[C];2007年

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本文編號：2805484