【摘要】：目的:1.檢測(cè)乙硫氨酸腹腔注射C57BL/6孕鼠是否可以引起胎鼠神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTD_S)的發(fā)生。2.從C57小鼠中提取原代神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs),并進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定,為研究乙硫氨酸引起神經(jīng)管畸形的研究提供細(xì)胞模型。3.通過研究乙硫氨酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞功能的影響,初步研究乙硫氨酸在其引起的C57BL/6小鼠胚胎神經(jīng)管畸形發(fā)生過程中的作用。方法:1.通過腹腔注射的方式,將乙硫氨酸以100 mg/kg的劑量注入到C57BL/6懷孕第7.5天(E7.5)母鼠體內(nèi),然后繼續(xù)飼養(yǎng)至E9.5、E10.5和E11.5時(shí)分別提取分離出完整的胚胎,通過體視顯微鏡及HE染色的方法觀察及檢測(cè)E10.5和E11.5時(shí)胚胎的前腦、后腦的閉合情況,對(duì)造模的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。2.從孕E13.5天的C57胎鼠腦組織中,通過機(jī)械法提取原代NSCs,然后用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng);用免疫熒光染色法通過檢測(cè)NSCs的Nestin特征蛋白來初步鑒定NSCs;然后再次用免疫熒光染色法檢測(cè)其分化后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征蛋白來進(jìn)行進(jìn)一步的NSCs分化鑒定。3.將乙硫氨酸加入到神經(jīng)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基中,將實(shí)驗(yàn)分為兩組:對(duì)照組(正常培養(yǎng)的NSC組)、實(shí)驗(yàn)組(加乙硫氨酸培養(yǎng)的NSC組),兩組細(xì)胞各培養(yǎng)一段時(shí)間,在熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)并攝片,在Image-J軟件下,隨機(jī)選取每組5-10個(gè)不同的視野進(jìn)行神經(jīng)球的計(jì)數(shù)并用GraphPad Prism 5軟件分析作圖,以此觀察其集落形成能力、神經(jīng)球的形成比例以及細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),初步推斷乙硫氨酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的影響。4.通過Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖變化情況;5.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞凋亡的變化情況。6.通過Western blotting蛋白印跡法法檢測(cè)Caspase 3蛋白表達(dá)變化。7.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞周期的變化情況。8.通過免疫熒光的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組分化情況的差異。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法:數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件,兩個(gè)樣本均數(shù)間差異采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)采用方差分析,*表示P0.05,**表示P0.01,***表示P0.001,當(dāng)P0.05時(shí)可認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)作圖使用GraphPad Prism 5軟件以及Image-J灰度值分析軟件。結(jié)果:1.乙硫氨酸腹腔注射懷孕E7.5的C57BL/6孕鼠,成功誘導(dǎo)出小鼠NTDs,最佳致劑量為100 mg/kg,NTDs發(fā)生率為54.7%,小鼠NTDs主要表現(xiàn)為顱面畸形和發(fā)育遲緩,其它畸形有后腦神經(jīng)管未閉、前腦發(fā)育不足等;HE染色可見神經(jīng)管畸形胎鼠前后腦泡未閉合,結(jié)構(gòu)異常。2.原代提取的NSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好。Nestin免疫熒光染色呈陽(yáng)性;NSCs分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征性蛋白NF-H、MAP2、GFAP和GALC,結(jié)果也均呈陽(yáng)性顯色。3.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在集落形成能力和神經(jīng)球的形成比例上均有差異,最佳添加濃度為10 mmol/L;對(duì)照組集落形成能力顯著高于實(shí)驗(yàn)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12.60±1.074 vs.5.50±0.893,t=10.80,P0.05)。實(shí)驗(yàn)組直徑小于100μm的神經(jīng)球的數(shù)量雖比對(duì)照組的多,但對(duì)照組在直徑大于100μm的神經(jīng)球的數(shù)量上的遠(yuǎn)多于實(shí)驗(yàn)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.CCK-8法結(jié)果得出:實(shí)驗(yàn)組0 h時(shí)的吸光度值(OD)與對(duì)照組無明顯差異,而接下來的1-5天的OD值,實(shí)驗(yàn)組則顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1d:t=7.227,P=0.0019;2d:t=8.855,P=0.0009;3d:t=15.95,P0.0001;4d:t=31.83,P0.0001;5d:t=9.017,P=0.0008)。表明乙硫氨酸顯著降低了NSCs的增殖能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.流式結(jié)果顯示:早凋率和晚凋率的變化與時(shí)間成正比例關(guān)系,隨著NSC_S體外給予乙硫氨酸干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),早凋率和晚凋率都逐漸升高,總凋亡率也隨著NSC_S體外給予乙硫氨酸干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(總凋亡0 h vs.72h:P=0.0037,總凋亡48 h vs.72 h:P=0.0141,總凋亡0 h vs.48 h:P=0.0084)。6.Western blotting法顯示,在Caspase3蛋白表達(dá)量上,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組高,P0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.流式結(jié)果顯示:處于G1期的細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P0.0001),而處于S和G2期的細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P_S=0.0002,P_(G2)=0.0021),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞被捕獲在了G1期,無法進(jìn)入S期。8.免疫熒光結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力都低于對(duì)照組。結(jié)論:1.乙硫氨酸腹腔注射可引起C57BL/6胎鼠NTD_S,提示葉酸的甲硫氨酸循環(huán)代謝障礙與NTD_S發(fā)育有關(guān),且此模型的建立為后續(xù)研究甲硫氨酸循環(huán)障礙與NTD_S的關(guān)系即乙硫氨酸在NTD_S中的作用提供了動(dòng)物模型依據(jù)。2.經(jīng)過一系列的提取、培養(yǎng)、鑒定,成功的為后面的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞模型。3.通過研究乙硫氨酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞功能的影響,初步表明乙硫氨酸可能通過引起神經(jīng)干細(xì)胞的增殖減少,凋亡增多及干擾神經(jīng)干細(xì)胞的分化功能在引起C57BL/6小鼠胚胎神經(jīng)管畸形的發(fā)生過程中發(fā)揮了一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R748
【圖文】：

圖 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色圖圖 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色圖。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 圖對(duì)應(yīng)的腦部 HE 染色圖（×25C：A 圖對(duì)應(yīng)的前腦 HE 染色圖（×48）；D：A 圖對(duì)應(yīng)的后腦 HE 染色圖（×48）；E:E10.5 畸胎鼠（×48）；F：B 圖對(duì)應(yīng)的腦部全胚胎染色圖（×25）；G：B 圖對(duì)應(yīng)的前腦 HE 染色圖（×48H：B 圖對(duì)應(yīng)的后腦 HE 染色圖（×48）

圖 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色圖圖 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色圖。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 圖對(duì)應(yīng)的腦部 HE 染色圖（×25）；C：A 圖對(duì)應(yīng)的前腦 HE 染色圖（×48）；D：A 圖對(duì)應(yīng)的后腦 HE 染色圖（×48）；E:E10.5 畸形胎鼠（×48）；F：B 圖對(duì)應(yīng)的腦部全胚胎染色圖（×25）；G：B 圖對(duì)應(yīng)的前腦 HE 染色圖（×48）；H：B 圖對(duì)應(yīng)的后腦 HE 染色圖（×48）

圖 2-1 顯微鏡下提取 NSCs 過程（×40）小鼠雙側(cè)子宮取出的串珠狀子宮；B：剝離了蛻膜組織的完整胎鼠離顱骨暴露出的腦組織；D：剝離腦膜后底面觀察到的完整腦組織胞培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)學(xué)觀察 NSCs 細(xì)胞初時(shí)呈圓形，體積較小，胞體透明，折光性強(qiáng) A）。經(jīng)兩三天的培養(yǎng)，圓形細(xì)胞的體積逐漸增大，6-10成啞鈴狀，細(xì)胞形態(tài)慢慢變圓，細(xì)胞球雖不大，但開始形成（胞純度高，狀態(tài)好，增殖快，形成的細(xì)胞球數(shù)量越來越多成較大細(xì)胞球（圖 2-2 C）。由于球體中心部比較膨隆立代以后有些大的細(xì)胞球因?yàn)榫o緊形成一個(gè)獨(dú)立體，營(yíng)養(yǎng)無態(tài)變差（圖 2-2 D）。

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本文編號(hào)：2794794