【摘要】：目的:人腦膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的原發(fā)腫瘤,惡性程度較高,往往可迅速擴(kuò)散至遠(yuǎn)離原發(fā)灶的腦組織,且與周圍腦組織浸潤程度深,故手術(shù)很難將膠質(zhì)瘤組織完全切除。目前,全世界范圍內(nèi)的膠質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)治療方法為,手術(shù)切除,術(shù)后加以同步放化療等綜合治療方法。在最新的世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類(2016)中首次將分子生物標(biāo)記與典型的組織學(xué)特征結(jié)合起來,以定義不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤?新的神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷方法間接說明了對(duì)腦腫瘤生物學(xué)行為理解更深了一層?同時(shí),膠質(zhì)瘤患者個(gè)體化治療被越來越重視,可能成為今后膠質(zhì)瘤治療的突破口。WNK蛋白激酶家族由四個(gè)成員組成,WNK1、WNK2、WNK3和WNK4,其特征在于保守催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的典型序列變異,因其功能結(jié)構(gòu)域上缺乏賴氨酸而得名。盡管大多數(shù)研究都集中在WNK1,WNK3和WNK4在調(diào)節(jié)腎臟和腎外組織中不同離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的作用,但越來越多的證據(jù)表明WNK激酶在與癌癥相關(guān)的各種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用,它們?cè)贕1/S細(xì)胞周期進(jìn)展、代謝性腫瘤細(xì)胞適應(yīng)、逃避凋亡和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮作用。然而,WNK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬表型相關(guān)研究尚屬空白。研究方法:在實(shí)驗(yàn)中,我們首先利用免疫組化檢測(cè)到了WNK3在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況,同時(shí)也采用Western blot方法檢測(cè)了WNK3在三種實(shí)驗(yàn)常用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251、U373的表達(dá)程度。隨后,我們構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒進(jìn)行“瞬轉(zhuǎn)”,以達(dá)到干擾WNK3基因在U87細(xì)胞系中的表達(dá)的目的,并使用Western blot方法進(jìn)行檢驗(yàn),觀察WNK3基因是否下調(diào)。接著,我們使用WNK3干擾的U87細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。使用CCK-8方法檢測(cè)相同濃度的TMZ作用于不同組別,觀察細(xì)胞存活率是否有明顯差異。同時(shí)使用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B,P62,Beclin1。最后,使用透射電鏡觀測(cè)經(jīng)替莫唑胺處理后的不同組別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,WNK3基因在U87、U251、U373三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均有高低程度不同地表達(dá)。同時(shí),在醫(yī)院收集到的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,我們發(fā)現(xiàn)WNK3基因在高級(jí)別膠質(zhì)瘤(GradeIII-IV)中的表達(dá)程度高于在低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Grade I-II)。通過WB方法檢測(cè),WNK3干擾后,經(jīng)過替莫唑胺處理U87的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白較陰性對(duì)照的表達(dá)量低。另外,在TMZ的作用下,經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)得在0、24、36、48h細(xì)胞存活率,發(fā)現(xiàn)在WNK3干擾的U87細(xì)胞活性低于正常的U87細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過替莫唑胺作用后的shRNA-WNK3 U87細(xì)胞,通過透射電子顯微鏡所見的雙層膜結(jié)構(gòu)及內(nèi)含殘余細(xì)胞器的自噬體和空泡單膜的自噬溶酶體較陰性對(duì)照組少。結(jié)論:以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WNK3干擾可減少替莫唑胺作用下膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的自噬作用,可能通過自噬表型的改變來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物替莫唑胺的耐藥性,可能是未來膠質(zhì)瘤治療方向中的作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4
【圖文】：

11乃1tH7飛

圖 2 經(jīng)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后，成功構(gòu)建出 shRNA-WNK3 U87 細(xì)胞系，WNK3 表達(dá)量與對(duì)照組相比有明顯降低3.3 CCK-8 法檢測(cè) WNK3 聯(lián)合不同劑量替莫唑胺對(duì) U87 增殖的影響為了探究 WNK3 對(duì) U87 細(xì)胞化療敏感性的是否有增強(qiáng)作用，我們采用不濃度梯度的 TMZ 進(jìn)行 CCK-8 實(shí)驗(yàn)。WNK3 轉(zhuǎn)染 U87 和質(zhì)�？辙D(zhuǎn)的 U87 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后8小時(shí)換全新含有不同劑量的TMZ ( 0, 50, 100, 200, 400uM)的DMEM培養(yǎng)基，作用時(shí)長(zhǎng)達(dá) 24 小時(shí)，利用 CCK-8 法進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞活性，公式：細(xì)胞活性=[(試驗(yàn)孔吸光度-空白組吸光度) / (對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)]*100%。CCK-8 結(jié)果顯示(圖 3), 空轉(zhuǎn)+TMZ 組及 WNK3 干擾+TMZ 組劑量依賴性地抑制了 U87 細(xì)胞活性。同時(shí)，相比于對(duì)照組，WNK3 干擾組中 TMZ 誘導(dǎo)細(xì)胞活性明顯低于空轉(zhuǎn)對(duì)照組。證明了轉(zhuǎn)染 WNK3 后，可大大增強(qiáng) TMZ 對(duì)膠質(zhì)瘤 U87細(xì)胞增殖抑制作用。

圖 2 經(jīng)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后，成功構(gòu)建出 shRNA-WNK3 U87 細(xì)胞系，WNK3 表達(dá)量與對(duì)照組相比有明顯降低3.3 CCK-8 法檢測(cè) WNK3 聯(lián)合不同劑量替莫唑胺對(duì) U87 增殖的影響為了探究 WNK3 對(duì) U87 細(xì)胞化療敏感性的是否有增強(qiáng)作用，我們采用不濃度梯度的 TMZ 進(jìn)行 CCK-8 實(shí)驗(yàn)。WNK3 轉(zhuǎn)染 U87 和質(zhì)�？辙D(zhuǎn)的 U87 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后8小時(shí)換全新含有不同劑量的TMZ ( 0, 50, 100, 200, 400uM)的DMEM培養(yǎng)基，作用時(shí)長(zhǎng)達(dá) 24 小時(shí)，利用 CCK-8 法進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞活性，公式：細(xì)胞活性=[(試驗(yàn)孔吸光度-空白組吸光度) / (對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)]*100%。CCK-8 結(jié)果顯示(圖 3), 空轉(zhuǎn)+TMZ 組及 WNK3 干擾+TMZ 組劑量依賴性地抑制了 U87 細(xì)胞活性。同時(shí)，相比于對(duì)照組，WNK3 干擾組中 TMZ 誘導(dǎo)細(xì)胞活性明顯低于空轉(zhuǎn)對(duì)照組。證明了轉(zhuǎn)染 WNK3 后，可大大增強(qiáng) TMZ 對(duì)膠質(zhì)瘤 U87細(xì)胞增殖抑制作用。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王帥;趙曉麗;朱晗;;替莫唑胺治療復(fù)發(fā)性原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的臨床效果[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2019年04期

2 郭珊珊;朱仲玲;徐輝;丁鳳霞;王國成;趙敏;閻昭;;替莫唑胺酯對(duì)腦膠質(zhì)瘤的作用及其機(jī)制研究[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2015年13期

3 王毓;謝莉;胡世頡;李兵;韓林章;;腦膠質(zhì)瘤術(shù)后口服替莫唑胺的護(hù)理體會(huì)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年23期

4 鐘誠;王彬;呂勝青;;替莫唑胺在腫瘤化療中的應(yīng)用進(jìn)展[J];中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2013年12期

5 李宏業(yè);徐軍;周士振;王秀華;趙玉娥;朱玉方;陶榮杰;;替莫唑胺配合放療治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的臨床觀察[J];中華腫瘤防治雜志;2010年12期

6 孫國濤;孫祥民;陶榮杰;;替莫唑胺治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤5例分析[J];慢性病學(xué)雜志;2010年11期

7 韋敏;肖億;;替莫唑胺的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2006年12期

8 蔡霞 ,馮光玲 ,任業(yè)明;替莫唑胺的合成[J];山東醫(yī)藥工業(yè);2003年04期

9 杜小莉;治療頑固性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的新藥——替莫唑胺[J];中國藥學(xué)雜志;2000年02期

10 陳澤慧;張躍強(qiáng);;原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤患者接受放療與替莫唑胺為主的化療治療效果[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2019年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 鞠海濤;李紅;王宏偉;竇長(zhǎng)武;;惡性膠質(zhì)瘤化療中替莫唑胺的不良反應(yīng)分析[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)神經(jīng)外科專業(yè)委員會(huì)第二屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2015年

2 徐軍;周士振;朱玉方;陶榮杰;;替莫唑胺配合放療治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的臨床研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

3 田新華;林曉寧;林錦超;魏峰;莊再旺;任磊;陳鍔;孫瑾;;替莫唑胺聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備方法比較[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

4 姚龐妹;;10例膠質(zhì)瘤患者超早期口服替莫唑胺化療的護(hù)理[A];2014浙江省神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2014年

5 劉瑜潔;齊憲榮;;基于臨床的環(huán)巴胺膠束與替莫唑胺聯(lián)用的抗腦膠質(zhì)瘤研究[A];2015年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十五屆中國藥師周論文集[C];2015年

6 孫濤;董瑩;張矛;;替莫唑胺聯(lián)合放射治療在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者治療中的作用研究[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

7 許建萍;張湘茹;李峻嶺;王宏羽;王燕;郝學(xué)志;石遠(yuǎn)凱;;替莫唑胺聯(lián)合伊立替康治療復(fù)發(fā)性非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的療效和毒副作用分析[A];中國腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

8 陳瑩;李德馨;喬艷麗;肖梅;張悅;王國成;王永峰;;反相離子對(duì)色譜二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定替莫唑胺酯原料的有關(guān)物質(zhì)[A];2009年中國藥學(xué)大會(huì)暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

9 陳瑩;李德馨;喬艷麗;肖梅;張悅;王國成;王永峰;;反相離子對(duì)色譜二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定替莫唑胺酯原料的有關(guān)物質(zhì)[A];2010年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

10 田新華;林曉寧;林錦超;魏峰;莊再旺;任磊;陳鍔;孫瑾;;腦靶向載替莫唑胺聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前8條

1 徐道;抗腦瘤老藥替莫唑胺煥發(fā)生機(jī)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

2 國訊;英國提示替莫唑胺的肝臟損害風(fēng)險(xiǎn)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2014年

3 董江萍;FDA增加替莫唑胺的骨髓抑制警告[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

4 ;替莫唑胺新適應(yīng)癥獲批[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

5 劉民;替莫唑胺可長(zhǎng)期治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

6 雷諾島;徹底擊斃毀滅性疾病[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2011年

7 鄭智敏;追逐新星[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

8 中華核醫(yī)學(xué)專業(yè)網(wǎng);美國發(fā)布——腫瘤臨床研究重大進(jìn)展[N];健康報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 樊天禹;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中抑制EZH2的表達(dá)改善替莫唑胺化療敏感性的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 王強(qiáng);木犀草素的抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用及其機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2016年

3 楊帥;逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤貝伐單抗和替莫唑胺治療耐藥的方法及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

4 邸輝;miR-874的過表達(dá)促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺化療敏感性的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

5 王君玉;CCND1異常表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性及替莫唑胺敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

6 林靖;泛素連接酶Fbw7在人腦膠質(zhì)瘤增殖、侵襲、遷移以及對(duì)替莫唑胺敏感性中的作用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

7 林洪;白藜蘆醇誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)替莫唑胺藥物敏感性作用的分子機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

8 余志云;替莫唑胺聯(lián)合二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤及其干細(xì)胞性能的影響及機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2016年

9 高幸;蟾毒它靈對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

10 張金鋒;ATM基因沉默誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐替莫唑胺的分子通路及臨床轉(zhuǎn)化研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳俊;柯里拉京與替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞增殖與凋亡的影響[D];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院;2019年

2 龍盛榮;WNK3對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬影響的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

3 尹建星;外泌體介導(dǎo)的miR-1238調(diào)控膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥機(jī)理研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

4 鄭林;MGMT基因甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療的療效分析[D];山東大學(xué);2019年

5 楊召;甲基化調(diào)控J蛋白通過ATM/Chk2信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤替莫唑胺耐藥及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

6 史夢(mèng)圓;替莫唑胺治療無基因突變非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移療效與安全的回顧性分析[D];鄭州大學(xué);2018年

7 賈駿;替莫唑胺通過血腦屏障能力的影響因素研究[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2018年

8 潘雅娜;單純?nèi)X放療與聯(lián)合替莫唑胺治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移灶療效及安全性比較的Meta分析[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2018年

9 張敏;順鉑聯(lián)合替莫唑胺治療MGMT啟動(dòng)子甲基化膠質(zhì)瘤的近期療效觀察[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

10 李齊印;替莫唑胺聯(lián)合甲氨蝶呤治療術(shù)后復(fù)發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的療效分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2793548