【摘要】：【背景】中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脫髓鞘疾病包括有視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSDs)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)、長節(jié)段橫貫性脊髓炎(Longitudinally Extensive Transverse Myelitis,LETM)、視神經(jīng)炎(optic neuritis,ON)等。目前臨床上最常見的是視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病與多發(fā)性硬化。上述兩者在發(fā)病機制,病理改變及治療上都存在著差異。自從2004年有外國學(xué)者發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)抗體后,該抗體被公認為NMOSDs最敏感且特異的免疫標(biāo)志物。雖然該抗體的發(fā)現(xiàn)對鑒別NMOSDs與MS具有重要的指導(dǎo)意義,但臨床上仍有10-40%的NMOSDs患者血清中檢測不到該抗體。目前的研究表明這部分AQP4抗體陰性的NMOSDs患者的病因尚未明確,猜測可能有其他抗體參與或介導(dǎo)NMOSDs的病理過程,CRMP5(collapsin response mediator protein 5)抗體就可能是其中一種。第一部分:CRMP5的質(zhì)粒組成及293T細胞模型的構(gòu)建【目的】構(gòu)建CRMP5質(zhì)粒,將人CRMP5基因進行擴增后轉(zhuǎn)染進人胚腎(human embryonic kidney,HEK)293T細胞內(nèi),構(gòu)建出細胞模型并用于血清CRMP5抗體的檢測�！痉椒ā�1.pEnter-CRMP5質(zhì)粒的構(gòu)建1.1.引物設(shè)計與合成通過軟件Premier 5.0進行引物的設(shè)計并參照Genebank中公布的人CRMP5基因序列,分別設(shè)計CRMP5基因的上游及下游引物,其中上游含ASCI引物酶,下游含NotI引物酶,以18s rRNA為內(nèi)參,送廣州銘善上生物公司進行合成。1.2.人CRMP5基因的獲取通過賽默飛公司的RNA提取試劑盒提取人體細胞的總核糖核苷酸(ribonucleic acid,RNA),為確保提取RNA的純度和完整性需對其進行檢測。之后用上述合成的CRMP5引物和人總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,從而得到它們的互補脫氧核糖核苷酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),再以CRMP5-cDNA為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增。然后將PCR產(chǎn)物回收,進行凝膠電泳來鑒定目的基因是否擴增成功。1.3.酶切及質(zhì)粒構(gòu)建將CRMP5-cDNA的PCR回收產(chǎn)物及pEnter載體分別用ASC I與Not I限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切,將CRMP5基因與pEnter載體通過T4連接酶進行連接后獲得CRMP5-pEnter質(zhì)粒,再以DH5α感受態(tài)細胞為底物,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入內(nèi)。將所得混合物加入含卡那霉素的LB平板內(nèi),置于含二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),挑取單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)后,通過Endo-free Plasmid Mini Kit II 50質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取并用于鑒定陽性克隆,同時以pEnter空載體做對照。1.4.pEnter-CRMP5質(zhì)粒的鑒定將提取后的質(zhì)粒進行雙酶切篩選,通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的完整性。然后將其送至廣州銘善上公司進行基因測序,對GeneBank中人CRMP5基因序列和銘善上公司的檢測結(jié)果進行Blast對比。2.CRMP5-293T細胞模型的構(gòu)建將凍存在液氮的HEK 293T細胞復(fù)蘇并進行培養(yǎng),轉(zhuǎn)染前1天對培養(yǎng)的293T細胞進行傳代,培養(yǎng)至融合度達70-80%時,通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000將CRMP5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞中。pEnter空載體做對照。3.CRMP5的表達鑒定轉(zhuǎn)染成功的細胞通過Western blotting和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IIFA)鑒定CRMP5在293T細胞上的表達情況。成功構(gòu)建的CRMP5-293T細胞模型將用于血清CRMP5抗體的檢測�！窘Y(jié)果】1.PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定:CRMP5-cDNA的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳鑒定,結(jié)果圖中可見與理論值一致的條帶(CRMP5:1695bp)。2.CRMP5質(zhì)粒的鑒定2.1.質(zhì)粒酶切凝膠電泳鑒定:電泳圖顯示在相應(yīng)理論值附近出現(xiàn)清晰的條帶,證明CRMP5質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2.基因測序分析鑒定:將基因測序結(jié)果與BLAST上的序列進行比對,原始序列與已知序列100%符合。3.CRMP5在細胞上的表達:Western blotting鑒定可見CRMP5-293T細胞表達蛋白在65kDa附近出現(xiàn)特異性條帶。細胞經(jīng)IIF法檢測發(fā)現(xiàn)與CRMP5陽性抗體結(jié)合的細胞表面及細胞內(nèi)激發(fā)紅色熒光,與4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核疊加。而pEnter空載細胞,293T細胞以及空白對照的細胞上未見相應(yīng)熒光模式�！窘Y(jié)論】成功克隆人CRMP5基因,構(gòu)建CRMP5-293T表達質(zhì)粒,并在293T細胞上穩(wěn)定表達,提示已經(jīng)成功地構(gòu)建出CRMP5-293T細胞模型。這是一種可靠的檢測患者血清抗體的實驗方法,為進一步深入研究NMOSDs可能存在的發(fā)病機制及病理變化提供有用的實驗根據(jù)。第二部分:CNS脫髓鞘疾病患者血清CRMP5抗體檢測【目的】通過構(gòu)建的CRMP5-293T細胞模型檢測CNS炎性脫髓鞘疾病患者血清中的CRMP5抗體,探索CRMP5抗體與該類疾病的關(guān)系。【方法】1.病例及血清收集收集2016年12月到2017年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診斷為CNS脫髓鞘疾病的患者共62例,所有患者均已進行血清AQP4抗體的檢測。包括:NMOSDs 16例,MS 13例,其他炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(other inflammatory neurological disease,OIND)患者15例、其他非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(other non-inflammatory neurological disease,OND)患者18例,另有健康對照20人。所有患者均未使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療,并在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈取血。2.血清中CRMP5抗體的檢測基于細胞法(cell based assay,CBA)的間接免疫熒光方法檢測患者血清中的CRMP5抗體,所用二抗為花青素?zé)晒?(cyanine,CY3)標(biāo)記鼠抗人IgG。3.商業(yè)型免疫印跡試劑盒驗證細胞法檢測的結(jié)果通過商業(yè)型免疫印跡試劑盒(神經(jīng)元抗原譜2抗體(IgG)檢測試劑盒)(EUROIMMUN,Neuronal Antigens Profile 2 EUROLINE)對上述所有標(biāo)本進行檢測,可見CBA法檢測CRMP5抗體陽性的患者血清在印跡條上出現(xiàn)與理論值相符的目標(biāo)條帶,而抗體陰性患者未見目標(biāo)條帶,進一步證實了細胞模型的成功建立及患者血清CRMP5呈陽性。4.統(tǒng)計分析所有結(jié)果經(jīng)過社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包(statistical package for social sciences,SPSS)16.0進行分析處理。本實驗結(jié)果數(shù)據(jù)為分類變量資料,組間陽性率進行X~2檢驗,p小于0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義�！窘Y(jié)果】CRMP5抗體與CNS脫髓鞘疾病的關(guān)系細胞免疫熒光法檢測16例視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMOSDs),陽性1例(6.25%);13例MS患者血清,陽性1例(7.69%);15例其他炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(OIND),陽性0例(0%);18例其他非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(OND),陽性0例(0%);20例健康人對照,陽性0例(0%)。采用商業(yè)型免疫印跡試劑盒檢測上述血清結(jié)果與CBA法檢測結(jié)果完全一致。最后采用卡方檢驗評估各組陽性率,結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.316)�！窘Y(jié)論】成功地構(gòu)建了一種基于細胞轉(zhuǎn)染的方法來檢測血清中的CRMP5抗體,有助于臨床診斷CRMP5抗體相關(guān)性疾病。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R744.5
【圖文】：

P5 質(zhì)粒的構(gòu)建和 CRMP5-293T 細胞模的條帶(圖 3)。由所作的灰度分3T 細胞和空載體 pcDNA3.1+ IIFA（indirect immunofluoresce表達 CRMP5 蛋白并與一抗（小二抗結(jié)合反應(yīng)后在細胞質(zhì)和胞合，而在空載細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)光。證明轉(zhuǎn)染 CRMP5-293T 細胞附 圖

在 CRMP5 基因（1695bp）標(biāo)記附近出現(xiàn)清晰的條帶，說明 CRMP5 基因已成功載入 pEnter 質(zhì)粒中。（圖2）1.3.CRMP5 質(zhì)�；驕y序鑒定將提取的 CRMP5 質(zhì)粒送至廣州銘善上生物公司進行基因測序，將所得結(jié)果與Genbank 中的人 CRMP5 基因序列進行 BLAST 對比分析可知：基因 CRMP5(1695bp)已成功克隆入至載體 pEnter 中，原始序列與 Genbank 中的已知序列 100%符合，提示該質(zhì)�？捎糜诤罄m(xù)的實驗。2. CRMP5 在 293T 細胞中的表達鑒定2.1.Western blotting 法鑒定采用Western blotting實驗方法測定CRMP5的蛋白表達量，可檢測到在分子量65kDa附近處出現(xiàn) CRMP5-293T 細胞的特異性條帶，而 293T 細胞及空載體 pcDNA3.1+ 處并未檢測到特異性條帶。以 GAPDH 為內(nèi)參，分子大小約為 36 kDa，在各組 36 kDa 大小

2: 雙酶切鑒定 CRMP5 質(zhì)粒泳道 M1：1kb DNA Ladder Marker；泳道 1：分別為 CRMP5-1 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 2：分別為 CRMP5-2 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 3：分別為 CRMP5-3 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 4：分別為 CRMP5-4 的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物；泳道 M2：DL2000 DNA Marker酶切結(jié)果分析：CRMP5（1695bp）在相應(yīng)的位置切出一條目的條帶（紅色箭頭所指到有陽性克隆，送 CRMP5 陽性質(zhì)粒去測序。

【相似文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 梁俊彥;CRMP5-293T細胞模型的構(gòu)建及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中的意義[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2788182