【摘要】：腦膜瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,其發(fā)病率約占顱內(nèi)所有原發(fā)腫瘤的15-25%。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的最新病理分級(jí),腦膜瘤可分為WHO Ⅰ、WHO Ⅱ和WHO Ⅲ三個(gè)級(jí)別。其中WHO Ⅱ和WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤較WHO Ⅰ級(jí)增殖活躍,復(fù)發(fā)率高且預(yù)后不佳。手術(shù)治療是針對(duì)高級(jí)別腦膜瘤首選的治療方式,但是影響其復(fù)發(fā)的因素及后續(xù)的治療選擇也較低級(jí)別腦膜瘤更加復(fù)雜。在過(guò)去的幾十年中,外科技術(shù)、放射治療技術(shù)、藥物治療方面都取得了很多進(jìn)步,高級(jí)別腦膜瘤的整體生存率也略有改善,但是,仍然需要更多的前瞻性數(shù)據(jù)。目前,世界上有大量的基于微創(chuàng)技術(shù)和分子靶向治療技術(shù)發(fā)展的臨床試驗(yàn),試圖獲取治療高級(jí)別腦膜瘤的新的突破,因此,深入研究惡性腦膜瘤增殖失控的具體機(jī)制,尋找影響腦膜瘤發(fā)生發(fā)展的可靠的關(guān)鍵靶標(biāo)就顯得更加迫切,這些研究都將為后續(xù)臨床干預(yù)腦膜瘤提供理論和實(shí)驗(yàn)支撐。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)結(jié)合的鋅指蛋白1 (RIZ1)定位于1p36,目前被認(rèn)為是一種重要的抑癌基因。最近的研究表明,該基因在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們前期研究中發(fā)現(xiàn),RIZ1基因蛋白水平與腦膜瘤的病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān),而在惡性腦膜瘤細(xì)胞系IOMM-Lee中過(guò)表達(dá)RIZ1可抑制細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,并且能夠進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。更深入的研究表明,過(guò)表達(dá)RIZ1能降低c-Myc的表達(dá)。UbcH10是泛素結(jié)合酶家族的重要成員,其異常高表達(dá)具有致癌作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),UbcH10在腦膜瘤組織中的表達(dá)與腦膜瘤的病理分級(jí)正相關(guān),且高表達(dá)的UbcH10提示了更差的預(yù)后。另外還發(fā)現(xiàn)c-Myc的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)UbcH10的表達(dá)。因此,我們推測(cè),RIZ1是否通過(guò)c-Myc調(diào)控UbcH10使腦膜瘤保持惡性增殖,而這其中的具體機(jī)制尚不了解。本實(shí)驗(yàn)首先從手術(shù)切除的新鮮腦膜瘤組織標(biāo)本中培養(yǎng)并鑒定了 2株間變性(WHO Ⅲ級(jí))腦膜瘤原代細(xì)胞,通過(guò)免疫組化和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)探討了 RIZ1和UbcH10的上下游關(guān)系,然后通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),觀察了 UbcH10在惡性腦膜瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能。最后,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)明確RIZ1依賴c-Myc調(diào)控UbcH10的具體機(jī)制。本研究共分為四個(gè)部分。第一部分:惡性腦膜瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定;第二部分:RIZ1和UbcH10上下游關(guān)系的研究;第三部分:敲低UbcH10的表達(dá)對(duì)惡性腦膜瘤原代細(xì)胞功能的影響;第四部分:RIZ1通過(guò)c-Myc調(diào)控UbcH10的機(jī)制研究。第一部分惡性腦膜瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定目的:培養(yǎng)惡性腦膜瘤原代細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供體外實(shí)驗(yàn)載體。方法:通過(guò)手術(shù)獲取新鮮人腦膜瘤組織標(biāo)本,利用化學(xué)消化法進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)所獲取細(xì)胞進(jìn)行腦膜瘤細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物鑒定。最后行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),觀察惡性腦膜瘤原代細(xì)胞的致瘤能力,獲取移植瘤標(biāo)本后再次行標(biāo)記物免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果:培養(yǎng)并鑒定了兩株間變性腦膜瘤(WHO Ⅲ級(jí))原代細(xì)胞,細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)雙極或多極形態(tài),生長(zhǎng)旺盛,均已進(jìn)行超過(guò)50次的細(xì)胞傳代。兩株惡性腦膜瘤細(xì)胞行免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示上皮膜抗原(EMA)和波形蛋白(VIM)均陽(yáng)性,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)獲取移植瘤行免疫組織化學(xué)分析EMA和VIM表達(dá)陽(yáng)性,Ki-67比例分別高達(dá)40%和33%。另外,為進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),同樣方法培養(yǎng)并鑒定出兩株WHO Ⅰ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞。WHO Ⅰ級(jí)腦膜瘤細(xì)胞傳至第10代左右后細(xì)胞體積逐漸增大,增殖速率減緩。結(jié)論:經(jīng)原代細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定,我們獲取了 2株WHO Ⅲ級(jí)和2株WHO Ⅰ級(jí)的人腦膜瘤原代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二部分RIZ1和UbcH10上下游關(guān)系的研究目的:明確UbcH10為RIZ1的下游分子。方法:通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)4株腦膜瘤原代細(xì)胞中RIZ1和UbcH10的表達(dá)情況。構(gòu)建針對(duì)RIZ1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染兩株WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞,觀察UbcH10表達(dá)水平變化。最后通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)分析52例不同病理級(jí)別腦膜瘤組織標(biāo)本中RIZ1和UbcH10的表達(dá)情況,并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者的表達(dá)量有無(wú)相關(guān)性。結(jié)果:RIZ1在WHO Ⅰ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞中高表達(dá),在2株WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞中表達(dá)較低,而UbcH10在WHO Ⅰ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞中表達(dá)較低,在WHOⅢ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞中表達(dá)較高。在2株WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RIZ1后,均檢測(cè)到UbcH10的表達(dá)水平降低。52例不同級(jí)別腦膜瘤標(biāo)本行免疫組織化學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),RIZ1的表達(dá)同腦膜瘤級(jí)別負(fù)相關(guān),而UbcH10相反,同時(shí)兩者的表達(dá)量負(fù)相關(guān)(P0.0001)。結(jié)論:UbcH10為RIZ1的下游分子。第三部分下調(diào)UbcH10對(duì)腦膜瘤原代細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究目的:初步研究UbcH10在腦膜瘤原代細(xì)胞中的生物學(xué)功能。方法:首先通過(guò)血清饑餓法將細(xì)胞同步化于G0/G1期,隨后釋放細(xì)胞,在此后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)UbcH10及細(xì)胞周期蛋白CyclinA2的表達(dá)變化。其次,設(shè)計(jì)合成針對(duì)UbcH10的siRNA干擾序列,轉(zhuǎn)染至2株惡性腦膜瘤原代細(xì)胞中,qRT-PCR和蛋白印跡檢測(cè)干擾效率。在UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染腦膜瘤原代細(xì)胞24h后行一系列細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)敲低UbcH10在惡性腦膜瘤原代細(xì)胞中的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖、周期、遷移、侵襲、凋亡的影響。結(jié)果:UbcH10在細(xì)胞周期各期表達(dá)不同,在G0/G1期表達(dá)最低。所設(shè)計(jì)siRNA轉(zhuǎn)染惡性腦膜瘤原代細(xì)胞后分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)到UbcH10的表達(dá)顯著下降。轉(zhuǎn)染UbcH10-siRNA后,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示腦膜瘤原代細(xì)胞增殖能力顯著下降,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示腦膜瘤原代細(xì)胞凋亡比率增加,并引起相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)變化。結(jié)論:UbcH10具有明顯的細(xì)胞周期相關(guān)性,且在惡性腦膜瘤的進(jìn)展中起著影響增殖、遷移、侵襲、凋亡等作用,是腦膜瘤細(xì)胞中潛在的致癌基因。第四部分RIZ1通過(guò)c-Myc調(diào)控UbcH10的機(jī)制研究目的:在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面研究RIZ1通過(guò)c-Myc調(diào)控UbcH10的分子機(jī)制。方法:染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-Myc是否與UbcH10啟動(dòng)子結(jié)合。構(gòu)建c-Myc在UbcH10啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的突變質(zhì)粒,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析RIZ1調(diào)控下游蛋白UbcH10是否依賴c-Myc。設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)c-Myc的RNA干擾慢病毒,并轉(zhuǎn)染W(wǎng)HO Ⅲ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞,在不同c-Myc背景下的惡性腦膜瘤原代細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染RIZ1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,檢測(cè)UbcH10的表達(dá)變化情況。結(jié)果:ChIP實(shí)驗(yàn)提示c-Myc在UbcH10啟動(dòng)子序列上有兩個(gè)穩(wěn)定的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示RIZ1需依靠c-Myc調(diào)控UbcH10的啟動(dòng)子活性。設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成了針對(duì)c-Myc的RNA干擾慢病毒,經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后得到穩(wěn)定敲低c-Myc表達(dá)的WHO Ⅲ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞。通過(guò)在不同c-Myc背景下原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RIZ1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,在野生型細(xì)胞和c-Myc穩(wěn)定敲低細(xì)胞中比較UbcH10表達(dá)的下降程度發(fā)現(xiàn)差異明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:RIZ1通過(guò)c-Myc調(diào)控UbcH10的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.45
【圖文】：

圖１．１邋４株人腦膜瘤原代細(xì)胞來(lái)源患者的影像學(xué)表現(xiàn)逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｉｍａｇｉｎｇ邋ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（Ｍｌ、Ｍ２來(lái)源于ＷＨＯ邋ＩＩＩ級(jí)間變性腦膜瘤，Ｍ３、Ｍ４來(lái)源于ＷＨＯ邋Ｉ級(jí)腦膜瘤，增逡逑強(qiáng)ＭＲＩ提示惡性腦膜瘤呈侵襲生長(zhǎng)，且瘤內(nèi)信號(hào)不均，部分呈分葉狀，腫瘤邊緣不逡逑規(guī)則。）逡逑邐表１．１腦膜瘤原代細(xì)胞來(lái)源標(biāo)本臨床詳細(xì)資料邐逡逑住院號(hào)邋性別邐年齡邐病理診斷邐ＷＨＯ分級(jí)逡逑￣Ｍ＼邐５４０８５５邐＾邐４６邐間變性腦膜瘤邐ｎＦ逡逑Ｍ２邐５９７３３４邐男邐５８邐間變性腦膜瘤邐ＩＩＩ逡逑Ｍ３邐６１８７８７邐女邐５８邐腦膜皮型腦膜瘤邐Ｉ逡逑Ｍ４邐６３１５４９邐男邐６０邐腦膜皮型腦膜瘤邐Ｉ逡逑（二）主要實(shí)驗(yàn)藥品及試劑逡逑高糖ＤＭＥＭ邐（加拿大ｗｉｓｅｎｔ公司）逡逑

二、腦膜瘤原代細(xì)胞特異性標(biāo)記物免疫熒光檢測(cè)結(jié)果逡逑原代腦膜瘤原代細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)傳代后，于第４代行細(xì)胞免疫熒光染色，４組細(xì)胞胞逡逑質(zhì)ＥＭＡ與ＶＩＭ表達(dá)均為陽(yáng)性（圖１．３）。逡逑Ｍ１（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ２（ＷＨ０邋ＩＩＩ）邋Ｍ３（ＷＨ０邋Ｉ邋）邋Ｍ４（ＷＨ０邋Ｉ邋）逡逑ＢＤＢＨ逡逑ａｎａ逡逑－１７邋－逡逑

逡逑圖１．３邋４株腦膜瘤原代細(xì)胞行細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋４邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑（細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示４株腦膜瘤原代細(xì)胞中ＥＭＡ和ＶＩＭ染色陽(yáng)性，圖中逡逑綠色熒光提示ＥＭＡ和ＶＭ在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性染色率超過(guò)９０％，藍(lán)色熒光為細(xì)逡逑胞核經(jīng)Ｈｏｅｃｈｓｔ染色后表現(xiàn)，白色標(biāo)尺＝２５ｇｍ。）逡逑三、腦膜瘤原代細(xì)胞裸鼠成瘤及移植瘤免疫組化結(jié)果逡逑對(duì)Ｍｌ邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）和Ｍ２邋（ＷＨＯ邋ＩＩＩ）邋２株ＷＨＯ邋ＩＩＩ級(jí)腦膜瘤原代細(xì)胞進(jìn)行裸鼠逡逑成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察其致瘤能力，接種２株細(xì)胞的雄性裸鼠均順利成瘤，對(duì)所獲取移植瘤逡逑行免疫組織化學(xué)分析，ＥＭＡ與ＶＭ均染色陽(yáng)性，Ｋｉ－６７指數(shù)分別高達(dá)４０％和３３％（圖逡逑１．４）。逡逑ＥＭＡ邐ＶＩＭ邐Ｋｉ－６７逡逑＇邋＿１邋．．逡逑Ｍ１邐．：偷．，ｉ邋．逡逑一逡逑Ｍ２邋？邐Ｖ邋：逡逑．—■．邐—邐W■—逡逑圖１．４裸鼠移植瘤免疫組織化學(xué)染色逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｎｕｄｅ邋ｍｉｃｅ逡逑（分別對(duì)Ｍｌ和Ｍ２細(xì)胞行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，獲取移植瘤行免疫組織化學(xué)分析，ＥＭＡ逡逑和Ｖ１Ｍ均染色陽(yáng)性

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3 孫金龍,于華強(qiáng),魏麟,龐琦,張慶林,鮑秀峰,孫煒;惡性腦膜瘤的臨床診斷及治療[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年02期

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5 張龍,梅良奎,汪新華,宋蓮淑;惡性腦膜瘤顱外轉(zhuǎn)移一例[J];中華神經(jīng)外科雜志;2003年04期

6 王

本文編號(hào)：2783581