【摘要】：研究背景與目的神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma NB)是兒童中一種最常見的惡性實體性腫瘤疾病,其發(fā)病率在兒童腫瘤中約占10%左右,此病的危害性僅次于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,預(yù)后效果較差。神經(jīng)母細胞瘤為一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,它起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細胞,好發(fā)生于腎上腺、頸部、胸部、腹部等神經(jīng)組織。大量臨床研究證實,神經(jīng)母細胞瘤具有惡性程度高、異質(zhì)性高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、預(yù)后差等多種臨床特點。目前,醫(yī)學(xué)針對神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療方案有限、效果不佳,除少數(shù)患者可自行緩解或進行腫瘤早期完全切除以外,大多數(shù)患者還存在預(yù)后較差,五年生存率低于40%的問題。分子生物學(xué)試驗顯示,體內(nèi)多種基因的異常表達與兒童神經(jīng)母細胞瘤的分級、治療和預(yù)后具有密切聯(lián)系,如MYCN異常表達、抑癌基因序列l(wèi)p36.1及l(fā)p36.2缺失等。目前,人們對于神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的詳細分子機制尚不明確。因此,研究神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病的分子機制,篩選調(diào)控腫瘤細胞增殖與分化的關(guān)鍵靶點,闡明其調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖與分化的作用機理,可以為神經(jīng)母細胞瘤的臨床診斷和治療提供新策略及新型方法,具有較大臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度在18-22 nt的非編碼小RNA分子,能夠與特定mRNA的3-UTR區(qū)互補結(jié)合,從而抑制mRNA的翻譯,調(diào)控基因蛋白水平的表達。研究表明,miRNA分子廣泛參與著細胞內(nèi)的各種生理病理過程,且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。例如,miR-23a能夠同時抑制st71表達且促進IKKα的表達,這種調(diào)控下進一步促進卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展進程;Zhao L等研究發(fā)現(xiàn),miR-490可以抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,且研究證明miR-490具有抑癌基因的功能。YuB等研究表明,miR-148a通過STAT和AKT信號通路靶向調(diào)控CCK-BR的表達,從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。大量證據(jù)顯示,miRNA在神經(jīng)母細胞瘤中也存在表達異�，F(xiàn)象,多種miRNA分子參與調(diào)控了神經(jīng)母細胞瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程,這表明miRNA在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)揮著重要作用。miR-25是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA分子之一,屬于miR-106b-25家族,位于人第7號染色體,在多種腫瘤中表達上調(diào),在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。Petrocca等研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇(miR-106b、miR-25、miR-93)在胃癌細胞中高表達,其表達受E2F1調(diào)節(jié)因子的調(diào)控,同時,miR-106b和miR-93又能調(diào)節(jié)E2F1的表達,因此形成了一個負反饋調(diào)節(jié)通路。在非小細胞肺癌中,miR-25表達上調(diào),且通過靶向FBXW7基因促進腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,具有癌基因的功能;miR-25參與調(diào)節(jié)多個靶基因,但其在神經(jīng)母細胞瘤中的功能及調(diào)控機制仍有待進一步研究。因此,在上述研究基礎(chǔ)上,本文旨在探討并明確miR-25在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機理。本文將分為三個部分進行研究,首先通過qRT-PCR方法從基因水平上驗證miR-25在神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中的表達情況,其次進一步從細胞水平驗證miR-25對神經(jīng)母細胞瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響,最后通過計算機軟件預(yù)測及分子生物學(xué)試驗探索miR-25在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)揮作用的機制�？傊�,本試驗為深入了解miRNA在神經(jīng)母細胞瘤中的功能及分子機制奠定了理論依據(jù)及技術(shù)支持。本論文的主要試驗框架及研究內(nèi)容如下圖所示:研究方法1.第一部分:miR-25在神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中的表達及臨床意義:首先收集34例患有小兒神經(jīng)母細胞瘤病的腫瘤組織,同時對收集的組織標本進行相關(guān)信息的記錄,采集的病料標本首先在液氮環(huán)境中進行迅速冰凍,隨后立即將標本儲存于-70 ℃冰箱中備用。迅速復(fù)蘇購買的神經(jīng)母細胞瘤細胞株,并用10%的胎牛血清對復(fù)蘇后的細胞進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)后再分別利用RNA提取試劑盒進行組織及細胞總RNA的提取,并反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA備用,最后試驗采用qRT-PCR方法檢測miR-25在神經(jīng)母細胞瘤組織及細胞中的基因表達水平。2.第二部分:miR-25對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、侵襲及遷移的影響:首先人工合成miR-25 mimics及miR-25 inhibitors,用綠色熒光蛋白進行標記;其次利用LipolifectmianrM2000將上述合成的樣品轉(zhuǎn)染至神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y和IMR32細胞株中,隨后進行細胞轉(zhuǎn)染率的檢測;本試驗利用CCK-8試驗檢測miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors 對細胞株 SH-SY5Y 和 IMR32 增值能力的影響;流式細胞術(shù)試驗檢測miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對神經(jīng)母細胞瘤細胞周期活性的影響;Transwell試驗檢測miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對細胞株SH-SY5Y和IMR32侵襲及遷移能力的影響。本試驗主要的目的是明確miR-25 mimics及miR-25 inhibitors對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。3.第三部分:miR-25靶基因TOB1的篩選及鑒定:首先利用生物信息學(xué)軟件對miR-25相關(guān)靶基因進行篩選;隨后人工構(gòu)建篩選的靶基因的野生型和突變性熒光素酶報告質(zhì)粒,將構(gòu)建的質(zhì)粒及對照空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中,鑒定熒光素酶活性并進行miR-25靶基因的初步判斷;最后細胞轉(zhuǎn)染miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors,分別在基因及蛋白水 平上檢測預(yù)測靶基因mRNA及蛋白表達變化水平,以達到通過雙向分析方法驗證miR-25對靶基因的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果1.相比較于低危組神經(jīng)母細胞瘤組織,高危組標本中miR-25的表達量顯著增加,且miR-25的表達量與腫瘤分期呈正相關(guān)性,即分期越高miR-25的表達量越多(P0.05)。相比較于原發(fā)瘤細胞,轉(zhuǎn)移瘤細胞中miR-25的表達量明顯增高(P0.05)。2.利用熒光顯微鏡對miR-25 mimics和miR-25 inhibitors轉(zhuǎn)染至細胞株SH-SY5Y和IMR32的成功效率進行檢測。CCK-8試驗檢測細胞增值率結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-25的高表達顯著促進了神經(jīng)母細胞瘤細胞的增值能力,其中與陰性對照組相比,在miR-25 mimics轉(zhuǎn)染細胞株IMR32之后的48-72 h內(nèi)細胞OD值顯著升高(P0.05),而下調(diào)miR-25的表達可抑制細胞株SH-SY5Y的細胞增殖能力。Transwell試驗檢測miR-25對神經(jīng)母細胞瘤細胞侵襲及遷移能力,研究結(jié)果顯示,miR-25可以顯著增強神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y和IMR32的遷移及侵襲能力。與對照組相比較,上調(diào)miR-25的表達之后我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細胞瘤細胞遷移至下孔的數(shù)量增加,這表明神經(jīng)母細胞瘤細胞的遷移及侵襲能力顯著提高(P0.05),此外,下調(diào)miR-25的表達后顯示神經(jīng)母細胞瘤細胞的遷移及侵襲能力明顯受到抑制(P0.05)。流式細胞術(shù)試驗分析腫瘤細胞在不同分期的細胞數(shù)量結(jié)果顯示,與對照組相比較,上調(diào)miR-25的表達可以使細胞株IMR32在S期的細胞數(shù)明顯增加,而在G1期時細胞數(shù)量顯著減少(P0.05),下調(diào)miR-25的表達后,可以使細胞株SH-SY5Y在G1期時細胞數(shù)量增多,而在S期的細胞數(shù)目顯著減少,這表明腫瘤細胞的增值能力受到影響且凋亡數(shù)量增加(P0.05)。因此我們猜想miR-25起作用的時期可能是在細胞尚未進行有絲分裂到即將要開始進行有絲分裂的過程中。3.利用靶基因預(yù)測軟件我們初步篩選出TOB1為miR-25的的潛在靶基因。雙熒光素酶試驗結(jié)果進一步證實miR-25可以與TOB1的3‘UTR結(jié)合,在進行共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)TOB1的表達量降低。為了在基因水平上進一步證實miR-25對TOB1 mRNA的影響,qRT-PCR試驗顯示上調(diào)miR-25可以顯著降低TOB1 mRNA的表達量(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示上調(diào)miR-25的表達后神經(jīng)母細胞瘤細胞中TOB1的表達量受到抑制(P0.05),而在低表達miR-25后神經(jīng)母細胞瘤細胞中TOB1的表達量增加(P0.05)。研究結(jié)論1.惡性神經(jīng)母細胞瘤組織標本及細胞中miR-25的表達量顯著高于低危性神經(jīng)母細胞瘤組織及細胞,因此miR-25可以作為神經(jīng)母細胞瘤高低危性診斷及預(yù)后判斷的一個重要性指標。2.上調(diào)miR-25的表達可以使神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著增強,而抑制miR-25的表達可以呈現(xiàn)相反的結(jié)果。此外,miR-25在神經(jīng)母細胞瘤細胞G1-S期起到明顯的干擾作用。因此miR-25在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)揮癌基因的作用。3.miR-25可以與TOB1的3'UTR靶向結(jié)合,且可以控制TOB1基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯,為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供新的靶點。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

１邐ｍｉＲ－２５對神經(jīng)母細胞痛增殖能力的影響逡逑為了深入探宄ｍｉＲ－２５在神經(jīng)母瘤細胞中的作用，本試驗選擇ＳＨ－ＳＹ５Ｙ和逡逑ＩＭＲ３２細胞采用ＣＣＫ－８方法進行體外研[�。试验结果壤_跡彼荊赴懼義希恚椋遙玻靛澹椋睿瑁椋猓椋簦錚蠔螅窬趕赴魷赴櫻齲櫻伲擔俚腦鮒乘俁讓饗韻碌鰨醫(yī)弦蹂義閑遠哉兆楸澩锪懇蠶陸擔礱饗碌鰨恚椋遙玻的芄灰種粕窬趕赴魷赴櫻齲義希櫻伲擔俚腦鮒常ㄍ跡保粒�，而在ＩＭ＿b常蠶赴泄澩錚恚椋遙玻島螅湓鮒乘俁讓麇義舷約涌

本文編號：2771869