【摘要】：背景:氯吡格雷治療后高血小板反應(yīng)性系多重因素共同作用的結(jié)果,明確氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制,對(duì)于評(píng)估藥物療效、做好個(gè)體化精準(zhǔn)治療具有十分重要的意義。多項(xiàng)研究均證實(shí)miR-223在氯吡格雷治療后高血小板反應(yīng)性的發(fā)生中可能起到一定的作用,但是其具體的機(jī)制尚不清楚,有待更為深入的研究。然而生物信息學(xué)分析顯示小鼠中miR-223與P2Y12可能并不存在靶向調(diào)控關(guān)系,這使得動(dòng)物水平上對(duì)于miR-223的研究受到了極大的限制。不僅如此,研究還面臨著氯吡格雷作為前體藥物需要肝藥酶代謝活化才能產(chǎn)生具有藥理活性的代謝產(chǎn)物,以及作為藥物靶標(biāo)的血小板為無(wú)核終末細(xì)胞不能進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)等等技術(shù)難題,這些都在某種程度上進(jìn)一步限制了研究的推進(jìn)。本研究通過(guò)建立氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?使得氯吡格雷可以直接在體外完成代謝活化并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),并利用該細(xì)胞模型相關(guān)實(shí)驗(yàn)與相關(guān)臨床研究,對(duì)氯吡格雷治療低反應(yīng)的機(jī)制的進(jìn)行了更深一步的探討。本研究共分為三個(gè)部分。第一部分MicroRNA-223與急性缺血性卒中患者血小板ADP受體P2Y12和氯吡格雷反應(yīng)性的相關(guān)性分析目的:探討急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療前后血小板膜蛋白P2Y12表達(dá)水平與血小板反應(yīng)性的關(guān)系,以及miR-223在其中的調(diào)控作用。方法:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性缺血性卒中患者治療前后ADP誘導(dǎo)血小板聚集率,通過(guò)血小板相對(duì)抑制率及八分位數(shù)法篩選出低反應(yīng)組和高反應(yīng)組,檢測(cè)極端病例治療前后血小板中P2Y12蛋白表達(dá)水平,并比較分析其在兩組極端病例中的差異;構(gòu)建病毒載體感染人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞MEG-01,下調(diào)miR-223水平,觀察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表達(dá)變化。結(jié)果:在急性缺血性卒中患者中,無(wú)論在治療前水平還是治療后水平,血小板P2Y12的蛋白表達(dá)水平與血小板聚集率均呈顯著正相關(guān)(p0.05)。高反應(yīng)組治療后較治療前P2Y12蛋白表達(dá)水平有所降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.073)。低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達(dá)的改變程度較高反應(yīng)組顯著減低(1.14604 vs 0.77097,p=0.031)。通過(guò)構(gòu)建病毒載體感染下調(diào)MEG-01細(xì)胞中miR-223水平,可以顯著升高P2Y12 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論:氯吡格雷低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達(dá)的相對(duì)降低程度較高反應(yīng)組顯著減低;在人血小板前體細(xì)胞中,miR-223可以調(diào)控ADP受體蛋白P2Y12的表達(dá)。第二部分氯吡格雷肝微粒體孵育液處理人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞模型的建立及其對(duì)miR-223表達(dá)的影響目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液處理人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞MEG-01的細(xì)胞處理模型,并探討氯吡格雷孵育液處理對(duì)miR-223表達(dá)所產(chǎn)生的影響,為從細(xì)胞水平探索氯吡格雷治療對(duì)人體血小板所產(chǎn)生影響提供新的方法學(xué)依據(jù)。方法:利用毒理學(xué)研究方法,以肝微粒體和氯吡格雷在適宜體系條件下共同孵育,獲得含有氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的孵育液。觀察不同濃度梯度和不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞后P2Y12蛋白水平的表達(dá)變化,確定細(xì)胞模型最佳處理濃度和時(shí)間,觀察細(xì)胞中miR-223表達(dá)變化。結(jié)果:在低(100ul/2ml)、高(200ul/2ml)兩種濃度下氯吡格雷孵育液處理MEG-01細(xì)胞后,P2Y12蛋白表達(dá)均無(wú)顯著變化(p0.05)。在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天的條件下,氯吡格雷孵育液組細(xì)胞膜P2Y12蛋白表達(dá)較對(duì)照肝微粒體孵育液組顯著降低42.6%(p0.01)。在以200ul/2ml的濃度分別連續(xù)處理3天、5天后,氯吡格雷孵育液處理的MEG-01細(xì)胞中miR-223表達(dá)分別下降了47.3%和32%(p值均0.05)。結(jié)論:在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理3-5天的條件下,氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞可以簡(jiǎn)單模擬氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物對(duì)巨核細(xì)胞和血小板產(chǎn)生作用的過(guò)程;用氯吡格雷藥物治療3天以上時(shí),miR-223表達(dá)水平會(huì)顯著降低。第三部分氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物通過(guò)P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223通路削弱其本身的P2Y12拮抗劑效應(yīng)目的:探討氯吡格雷孵育液處理細(xì)胞對(duì)C/EBPα表達(dá)所產(chǎn)生的影響,以及C/EBPα在氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)性調(diào)控機(jī)制中所起的作用。方法:觀察氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細(xì)胞后C/EBPα表達(dá)的變化;采用LY294002抑制劑處理MEG-01細(xì)胞選擇性抑制PI3K通路,觀察下游C/EBPα、miR-223和P2Y12表達(dá)的變化。結(jié)果:以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天后,相較于對(duì)照肝微粒體孵育液組,氯吡格雷孵育液組細(xì)胞膜蛋白P2Y12及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(p值均0.01)。連續(xù)處理3天或5天后,氯吡格雷孵育液組細(xì)胞C/EBPαmRNA表達(dá)均顯著降低(p值均0.01)。P2Y12 mRNA表達(dá)在連續(xù)處理3天時(shí)升高193.4%(p0.001),在連續(xù)處理5天時(shí)則顯著降低(p0.05,見圖)。LY294002處理7天后,MEG-01細(xì)胞中PI3K/Akt通路活性被顯著抑制,p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低,且與抑制劑濃度相關(guān)(p值均0.05)。轉(zhuǎn)錄因子C/EBPαmRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低,但蛋白水平與抑制劑濃度無(wú)明顯相關(guān)。結(jié)論:氯吡格雷肝微粒體孵育液處理后,細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達(dá)會(huì)顯著降低,并通過(guò)P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223環(huán)路對(duì)P2Y12通路的抑制進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。該負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路的過(guò)度激活,可能與氯吡格雷治療低反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.3
【圖文】：

圖 1.1 流式檢測(cè) ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率吡格雷治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達(dá)的變化篩選出的極端病例治療前后血樣分別進(jìn)行磁珠分選純化血小板并白，以 Western blot 檢測(cè)血小板膜蛋白 P2Y12 相對(duì)表達(dá)水平。相關(guān)不論在治療前還是治療后水平，血小板 P2Y12 蛋白表達(dá)水平均與呈正相關(guān)（治療前 r=0.814，圖 1.2 A；治療后 r=0.879，圖 1.2 B。治療前后兩組極端病例血小板 P2Y12 蛋白相對(duì)表達(dá)量分布如圖。與血小板反應(yīng)性類似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表達(dá)水平在個(gè)變異。無(wú)論在治療前水平還是治療后水平，LR 組與 HR 組相比 蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異。對(duì)每例患者治療前后的血小板蛋白比較可以發(fā)現(xiàn)，LR 組治療后與治療前相比無(wú)顯著變化，而 HR 組前 P2Y12 蛋白表達(dá)水平有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.073，圖據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，LR 組與 HR 組在治療前后血小板 P2Y12 蛋白表上可能存在差異。據(jù)此，本研究對(duì)每例患者進(jìn)行了治療前后蛋白的計(jì)算。定義治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達(dá)比值 R=治療后

p 值均<0.01）。治療前后兩組極端病例血小板 P2Y12 蛋白相對(duì)表達(dá)量分布如圖所示（圖1.2 C）。與血小板反應(yīng)性類似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表達(dá)水平在個(gè)體間存在較大變異。無(wú)論在治療前水平還是治療后水平，LR 組與 HR 組相比血小板P2Y12 蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異。對(duì)每例患者治療前后的血小板蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，LR 組治療后與治療前相比無(wú)顯著變化，而 HR 組治療后較治療前 P2Y12 蛋白表達(dá)水平有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.073，圖 1.2 D）。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，LR 組與 HR 組在治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達(dá)的變化程度上可能存在差異。據(jù)此

26圖 1.3 microRNA-223 對(duì)血小板膜蛋白 P2Y12 的調(diào)控作用1.3 討論1.3.1 氯吡格雷治療后低反應(yīng)的定義與檢測(cè)方法抗血小板藥物低反應(yīng)，過(guò)去更多被稱為抗血小板藥物抵抗，可分為臨床抵抗和實(shí)驗(yàn)室抵抗。前者是指患者服用標(biāo)準(zhǔn)劑量的抗血小板藥物卻不能有效避免或減少缺血性事件的再發(fā)，實(shí)驗(yàn)室抵抗是指抗血小板藥物不能有效抑制血小板聚集，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血小板聚集率等反應(yīng)血小板功能和活化的指標(biāo)在治療后未能產(chǎn)生預(yù)期效果。通常研究中噻酚吡啶類藥物的實(shí)驗(yàn)室抵抗是指阻斷 P2Y12 受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后并未起到抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)介導(dǎo)的血小板聚集效應(yīng)[23]。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2765001