【摘要】：研究背景近年來相關研究報道顯示,腦內神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥和多發(fā)性硬化的發(fā)生和發(fā)展有密切的關系。神經(jīng)炎癥是由于感染和損傷所引發(fā)的機體抵御機制,主要是由膠質細胞與淋巴細胞釋放的毒性因子介導所引起的。在先前動物模型使用的研究中,發(fā)現(xiàn)在大腦發(fā)生炎癥時,小膠質細胞和星形膠質細胞被激活,釋放促炎癥因子和抗炎因子以介導炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本次研究主要針對小膠質細胞所介導的炎癥反應進行研究,探討研究小膠質細胞在神經(jīng)炎癥中促進炎癥反應發(fā)生的主要作用,為干預炎癥反應進展提供新的研究方向。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中最小的膠質細胞,數(shù)量少,大概為CNS神經(jīng)膠質細胞的10%~20%。小膠質細胞在大腦神經(jīng)組織中扮演著主要免疫細胞的角色,同時也是神經(jīng)相關炎癥反應的最重要的免疫細胞。同時,無論在神經(jīng)元的生存還是生命活動中都發(fā)揮著重要的支持、保護、營養(yǎng)等作用,并且其外形與免疫系統(tǒng)樹突狀抗原呈遞細胞相似,有效保護CNS免于病原體侵蝕。小膠質細胞在激活的時候會釋放炎癥前細胞因子,如IL-1、TNF-α以及氮氧化物在內的一系列的炎性因子。在CNS的炎癥過程中小膠質細胞同時也表達許多細胞因子的受體,包括炎癥前細胞因子和抗炎性細胞因子受體,在調節(jié)和誘導小膠質細胞的免疫功能上起關鍵的作用。最近,也有相關文獻報道小膠質細胞與一些神經(jīng)退行性病變的疾病進程有一定的關聯(lián)。所以,對于神經(jīng)炎癥的研究中,針對小膠質細胞炎癥表達的治療是對神經(jīng)炎癥治療過程中一個重要的策略。核轉錄因子κB(Nuclear transcriptrion factorκB,NF-κB)是一種廣泛存在于真核細胞里具有多向轉錄調節(jié)作用的蛋白質,一般該蛋白以非激活的形式存在在幾乎所有類型細胞的胞質。NF-κB的激活可以通過多種細胞外信號進行調控NF-κB的靶基因。NF-κB在免疫應答、細胞增生及凋亡等重要功能發(fā)揮至關重要的作用,同時也與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)變性及可塑性變化等有關。吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是目前NF-κB的活性抑制劑。PDTC能夠改變氧化還原狀態(tài),金屬螫合作用,降低或抑制酶活性,能夠抑制通過激活NF-κB途徑在小膠質等多種細胞的反應。PDTC由二硫代氨基甲酸酯組成,能分解成異硫氰酸鹽和二硫化碳這兩種低分子硫醇抗氧化劑,影響NF-κB的DNA結合活性,從而減少NF-κB的活化;另外PDTC還可以直接抑制NF-κB,在LPS誘導的小鼠膿毒性休克模型的研究發(fā)現(xiàn),PDTC是通過減少NF-κB的核轉位,抑制NF-κB的活化,使致炎細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6基因的表達減少,炎性反應減輕,降低了小鼠的死亡率。PDTC作為一種抗氧化劑,還可以清除自由基的毒性作用,可以通過減少丙二醛等來降低氧化物質對細胞的損傷,能夠用于重金屬中毒和酒精中毒的解毒、癌癥和獲得性免疫抑郁綜合征等疾病的輔助治療。因此,本研究旨在探討脂多糖對BV-2神經(jīng)小膠質細胞的影響并觀察PDTC對其的干預效應。研究目的1、觀測脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)對BV-2神經(jīng)小膠質細胞的影響。2、探討吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)對小膠質細胞炎癥反應的干預效應研究方法1、細胞培養(yǎng)BV-2神經(jīng)小膠質細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育。每48h換液、傳代2次,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。2、對BV-2細胞進行傳代并隨機分為空白照組、L組和L+P組。3、其中對照組細胞加入PBS;L組加入LPS(1μg/ml);L+P組在加入LPS前30分鐘加入50μmol/L的PDTC溶液進行干預并置于培養(yǎng)箱中孵育24小時。4、經(jīng)培養(yǎng)24小時后,用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變,采用ELISA法測定BV-2小膠質細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,同時對細胞行免疫組化和Western blot觀察蛋白表達量的改變。結果1.光鏡下,O組、L組和L+P組BV-2細胞的形態(tài)學改變。靜止狀態(tài)下的小膠質細胞的形態(tài)為分支狀胞體呈圓形或者橢圓形。L組的BV-2細胞經(jīng)LPS(1ug/ml)24小時因刺激后活化的細胞數(shù)量明顯增加,細胞核體積明顯變大,并且細胞形態(tài)成“阿米巴樣”改變。然而,經(jīng)PDTC預先處理的L+P組中,在加入LPS 30分鐘前給予PDTC(50ug/L)進行預處理,活化形態(tài)發(fā)生變化的BV-2細胞相對于LPS組明顯減少。通過統(tǒng)計活化的小膠質細胞數(shù)占總細胞數(shù)量的比值我們可以得到相同的結果。L組活化的小膠質細胞占總細胞數(shù)量的比值明顯高于對照組(P0.05),而預先給予PDTC進行處理的L+P組明顯降低活化細胞比值(P0.05)。2.ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的結果中與O組比較,L組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度增高(P0.05);與L組比較,L+P組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度降低(P0.05)。3.通過Western blot結果顯示與O組比較,L組中NF-κB p65與TLR4在BV-2小膠質細胞中的表達量明顯增加(P0.05);與L組比較,L+P組中NF-κB p65與TLR4在BV-2小膠質細胞中的表達量明顯減少(P0.05)。結論1、LPS可誘導BV-2小膠質細胞激活發(fā)生形態(tài)變化,并且促使BV-2小膠質細胞釋放促炎癥因子。2、應用PDTC可干預LPS誘導的BV-2小膠質細胞,抑制小膠質細胞的激活,減少其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生。
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R741
【圖文】：

L+P 組圖 1 O 組、L 組與 L+P 組細胞形態(tài)學對比測細胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度的結果培養(yǎng)后，取細胞上清液離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物分裝清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度。 檢測結果顯示 L 組與空白對照組比較，L 組細胞上清液中 T（P < 0.05）；與 LPS 組比較，L+P 組細胞上清液 TNF-α、 < 0.05），見表 2 和圖 2。表 2 細胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度的比較（pg/ml，n=3，O 組 L 組 L+P 組104.1±10.6 141.2±10.2*114.7±5.1&220.9±46.3 350.1±9.5*256.1±51.837.9±6.9 59.9±3.9*43.8±6.8&注：與 O 組比較，*P < 0.05；與 L 組比較，&P < 0.05

GroupOGroupLGroupL+P0204060IL-6(pg/ml)圖 2 血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃t 結果時后取出細胞用細胞刮提取細胞，并用65、TLR4 不同組之間的表達情況。：與 O 組比較，L 組中 NF-κB p65 在 ）；與 L 組比較，L+P 組中 NF-κB p60.05）。O組 L組 L+P組

κB p65、TLR4 不同組之間的表達情況。p65：與 O 組比較，L 組中 NF-κB p65 在.05）；與 L 組比較，L+P 組中 NF-κB P < 0.05）。B P65ctinO組 L組 L+P組組 NF-κB p65 蛋白表達結果，與 O 組比較，與 O 組比較，L 組中 TLR4 在 BV-2 小比較，L+P 組中 TLR4 在 BV-2 小膠質細O組 L組 L+P組

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