發(fā)布時間：2020-07-16 23:36

【摘要】：目的:缺血性腦卒中后再灌注損傷引起的血腦屏障(BBB)破壞會加重水腫,引起進一步損傷,是卒中治療中的一大難題。周細胞作為BBB的重要組成部分,可通過與其他組分相互作用調(diào)節(jié)BBB的結(jié)構(gòu)和功能。以周細胞為靶點可能為卒中后BBB破壞評估和治療提供新思路。方法:本研究采用SD大鼠短暫性大腦中動脈栓塞模型(t MCAO)模擬急性缺血性腦卒中及再灌注,通過側(cè)腦室注射miR-149-5p的類似物149-agomir或抑制劑149-antagomir分別上調(diào)或下調(diào)腦梗死周邊區(qū)(IBZ)miR-149-5p水平,采用改良的神經(jīng)功能嚴重程度評分(m NSS)評估大鼠神經(jīng)功能缺損情況,采用磁共振(MRI)顯像和伊文氏藍滲漏實驗在體評估BBB通透性。腹腔注射鞘氨醇-1-磷酸受體(S1PR)2選擇性受體拮抗劑JTE-013抑制S1PR2受體活性。體外采用糖氧剝奪/復氧模型(OGD/R)模擬缺血缺氧條件,采用S1PR2 si RNA敲除細胞S1pr2基因表達,使用miR-149-5p類似物mimic或抑制劑inhibior分別上調(diào)或下調(diào)體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)miR-149-5p水平。采用劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測周細胞的遷移能力,Transwell體系共培養(yǎng)大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)和腦周細胞建立體外BBB模型,通過測量跨內(nèi)皮電阻(TEER)和FITC-葡聚糖通透率評估體外BBB模型的緊密型和通透性。實時-定量PCR(q RT-PCR)方法檢測大鼠血清、IBZ腦組織和細胞內(nèi)的miR-149-5p水平及相關(guān)基因m RNA表達水平。同時采用蛋白免疫印跡實驗檢測多種蛋白表達水平,免疫熒光共聚焦對S1PR2、PDGFR-β等進行定位。采用雙熒光素酶實驗驗證S1PR2為miR-149-5p直接靶點。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn),在體外OGD/R和大鼠tMCAO處理后,腦周細胞S1PR2的表達水平顯著增加。MRI顯像和伊文氏藍滲漏實驗發(fā)現(xiàn),與溶劑對照組相比,S1PR2受體拮抗劑JTE-013可明顯減輕t MCAO后大鼠BBB的滲漏;通過檢測Transwell共培養(yǎng)體系的TEER和FITC-葡聚糖的通透率發(fā)現(xiàn),減少周細胞S1PR2表達也可顯著增加體外BBB模型的跨內(nèi)皮細胞電阻,減少FITC-葡聚糖滲漏。同時,我們發(fā)現(xiàn)S1PR2可能通過NF-k B p65信號通路降低周細胞上N-鈣粘蛋白的表達,同時促進周細胞遷移。此外,miR-149-5p在t MCAO大鼠IBZ、外周血和OGD/R處理后的周細胞中顯著下降,其表達趨勢與周細胞上Sl PR2表達呈負相關(guān)。雙熒光素酶實驗證實S1PR2為miR-149-5p直接靶點。我們進一步在體外BBB模型中發(fā)現(xiàn),通過miR-159-5p類似物上調(diào)周細胞中miR-149-5p水平后,周細胞上N-鈣粘蛋白表達水平顯著增加,遷移能力減弱,BBB的通透性降低;而通過miR-159-5p抑制劑下調(diào)周細胞中miR-149-5p水平后,N-鈣粘蛋白表達水平明顯降低,遷移能力增強,BBB的通透性增加。同時,下調(diào)周細胞miR-149-5p水平所導致的N-鈣粘蛋白表達水平的降低,遷移能力的增強和BBB的通透性增加均可通過下調(diào)周細胞S1PR2的表達所逆轉(zhuǎn)。在t MCAO大鼠中,通過側(cè)腦室注射agomir-149-5p上調(diào)miR-149-5p可減輕體內(nèi)BBB通透性并顯著改善t MCAO大鼠的神經(jīng)功能結(jié)局,而下調(diào)miR-149-5p出現(xiàn)相反結(jié)果。結(jié)論:缺血再灌注早期周細胞上S1PR2受體表達增加,通過激活NF-k B p65信號通路減少N-鈣粘蛋白表達水平,促進周細胞的遷移,從而加重BBB滲漏,加重損傷。miR-149-5p可通過直接靶向S1PR2減輕BBB通透性,改善神經(jīng)功能結(jié)局。因此,我們推測,miR-149-5p可能成為缺血性卒中后評估和治療BBB破壞的潛在靶點。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

導致梗死核心擴大[1]。因此本實驗主要關(guān)注在急性缺血再灌注后梗死周邊區(qū)（IBZ）的變化（圖1）。圖 1 模式圖和免疫熒光染色顯示 tMCAO 大鼠 IBZ 部位 標尺=50 微米。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文首先為了檢測急性缺血/再灌后腦內(nèi) IBZ 中 S1PR2 變化規(guī)律，我們采用 qRT-PCR檢測 IBZ 中 S1PR2 mRNA 變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn) S1PR2 在 tMCAO 后 12h 開始表達增加，到第 1天達到高峰，持續(xù)增加至第 3 天，然后在第 5 天下降到正常水平（圖 2A）。同時蛋白免疫印跡實驗顯示 S1PR2 蛋白表達呈現(xiàn)相同的變化趨勢（圖 2B）。

圖 3 tMCAO 后不同時間點 IBZ 中周細胞 S1PR2 表達變化 假手術(shù)組和大鼠 tMCAO 后第12 小時、1 天、3 天、5 天和 7 天后腦切片 S1PR2 和 PDGFR- 雙重免疫熒光染色。標尺=20μm。n≥6。

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