【摘要】：背景膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)是顱內常見的原發(fā)性惡性腫瘤,起源于神經(jīng)上皮細胞。目前主要的治療途徑是手術切除聯(lián)合術后放化療,但預后較差,生存率較低。主要原因一方面是腫瘤呈浸潤性生長且大多處于顱內重要部位,手術往往不能徹底切除;另一方面是化療藥物難以跨過血腦屏障到達腫瘤部位且單一藥物治療效果較差。因此,新的治療策略亟待研究,聯(lián)合應用兩種或多種藥物并靶向遞送到腫瘤部位成為腫瘤治療策略研究的熱點。姜黃素(Curcumin,CUR)是從植物姜黃中提取的黃色多酚類天然活性物質,研究表明CUR具有增敏、抗炎、抗癌等多種藥理作用,其中抗癌作用已在動物實驗中得到反復驗證,但較差的水溶性限制了其應用;阿霉素(Doxorubicin,DOX)是臨床常用廣譜抗腫瘤藥物,存在治療窗短,耐藥性強,心臟毒性大等問題,有研究證實DOX與其他藥物聯(lián)合應用能夠提高其抗腫瘤效果并逆轉多藥耐藥。隨著納米醫(yī)學的出現(xiàn),納米結構的物理和化學性質與藥物有效遞送到腫瘤細胞的能力的關系被闡明,納米載藥系統(tǒng)因其能夠提高藥物利用率,增加藥物水溶性,延長藥物體內循環(huán)時間,實現(xiàn)腫瘤靶向及藥物共遞送等優(yōu)點受到關注,使用納米載藥復合物已成為神經(jīng)膠質母細胞瘤診治的潛在策略。有研究證明通過納米顆粒(Nanoparticles,NPs)共遞送不同藥物能夠有效提高藥物療效并實現(xiàn)藥物協(xié)同作用,具有廣闊的應用前景。近幾年,有文獻報道將化療藥物包載入NPs中可以顯著增強抗膠質母細胞瘤的效果,但不同類型納米顆粒及化療藥物作用于不同腫瘤的效果具有一定差別,優(yōu)良的制備方案及合適的診療策略仍亟待研究。本文采用薄膜水化法利用聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)包裹CUR和DOX自組裝制備出共載DOX和CUR的納米膠束PEG/DOX/CUR,并探討了DOX和CUR協(xié)同作用、PEG/DOX/CUR抗膠質母細胞瘤細胞的作用及其進入細胞的機制。目的探討PEG/DOX/CUR體外抗膠質母細胞瘤細胞的作用、DOX和CUR的協(xié)同作用及細胞攝取PEG/DOX/CUR的機制。方法1.制備并表征PEG/DOX/CUR。根據(jù)單因素考察法篩選出PEG/DOX/CUR的最優(yōu)制備方法。利用掃描電子顯微鏡、粒徑電勢掃描儀、熒光分光光度計、核磁共振波譜儀等對PEG/DOX/CUR進行表征;利用透析袋模擬體內釋放環(huán)境,測定DOX和CUR從PEG/DOX/CUR中釋放的效率;通過調節(jié)pH,模擬腫瘤組織環(huán)境,研究PEG/DOX/CUR在酸性環(huán)境中釋放DOX和CUR效率;2.研究DOX和CUR的協(xié)同作用及PEG/DOX/CUR抗膠質母細胞瘤細胞的作用。通過細胞毒性實驗測定細胞存活率,利用公式計算半數(shù)抑制濃度(50%Inhibiting concentration,IC50)及藥物聯(lián)合作用指數(shù)(Combination index,CI);通過鈣黃綠素(Calcein,CA)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)雙染實驗檢測PEG/DOX/CUR的促細胞凋亡作用;通過劃痕實驗研究PEG/DOX/CUR抑制細胞遷移的能力;3.探究PEG/DOX/CUR細胞攝取機制。利用共聚焦超分辨顯微鏡觀察PEG/DOX/CUR的細胞內化;利用流式細胞儀量化分析細胞攝取效率;通過抑制細胞跨膜轉運通道研究PEG/DOX/CUR進入細胞的機制。結果1.成功構建了雙載納米膠束PEG/DOX/CUR。投藥濃度為0.5 mg/mL,投藥比DOX:CUR:PEG為1:1:7,使用薄膜水化法構建的PEG/DOX/CUR粒徑最小,平均粒徑約60nm,多分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)小于0.2,Zeta電位約-47 mV,DOX與CUR包封率均大于90%,載藥量約為8%,PEG/DOX/CUR穩(wěn)定性良好;雙載納米膠束PEG/DOX/CUR具有緩慢釋藥的效果,體外釋放結果表明PEG/DOX/CUR中DOX和CUR呈現(xiàn)緩慢釋放現(xiàn)象,且在酸性環(huán)境中DOX和CUR釋放較快;2.雙載納米膠束PEG/DOX/CUR具有抗膠質母細胞瘤的作用。細胞毒性實驗結果顯示DOX和CUR聯(lián)合應用具有協(xié)同作用,空白NPs對細胞無明顯毒性,PEG/DOX/CUR能夠有效地促進細胞凋亡并抑制細胞遷移,不同濃度的PEG/DOX/CUR均具有協(xié)同抑制膠質母細胞瘤細胞的作用;3.雙載納米膠束PEG/DOX/CUR主要通過小窩蛋白介導的內吞途徑進入細胞。細胞攝取實驗結果顯示PEG/DOX/CUR能夠有效地進入細胞且具有時間、能量依賴性,表明雙載納米膠束PEG/DOX/CUR主要通過內吞途徑進入細胞;內吞途徑實驗結果表明PEG/DOX/CUR主要通過小窩蛋白介導的內吞途徑進入細胞。結論成功構建了PEG/DOX/CUR,粒徑小,穩(wěn)定性好且具有緩慢釋放的特性;PEG/DOX/CUR具有抗膠質母細胞瘤細胞的作用且DOX和CUR具有協(xié)同作用;PEG/DOX/CUR進入細胞的途徑主要是小窩蛋白介導的內吞途徑。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41
【圖文】：

實驗結果3 實驗結果3.1 PEG/DOX/CUR 制備及表征3.1.1 紫外分光光度計測定 DOX 含量方法的確定紫外光譜顯示 DOX 最大吸收峰位于 500 nm 處，特征性檢測結果顯示，在 500 nm 處CUR 及空白 NPs 對阿霉素的吸收無干擾，所以選擇 500 nm 作為 DOX 標準曲線測定波長。以 500 nm 處 DOX 的吸光度為縱坐標，DOX 的濃度為橫坐標，繪制出標準曲線，結果顯示線性關系良好。Y=0.01487 x+0.06196，R2=0.9999.

圖 2 CUR 含量測定方法的確定。a是 CUR熒光光譜；b 是 CUR專屬性熒光光譜；c 是 CUR濃度標準曲線。3.1.3 PEG/DOX/CUR 的制備表 1 是利用納米沉淀法、透析法、薄膜水化法制備的 PEG/DOX/CUR 的各項參數(shù)，結果顯示使用不同制備方法得到的 PEG/DOX/CUR的電位、分散系數(shù)及 DOX和 CUR的包封率無明顯差異，薄膜水化法制備得到的 PEG/DOX/CUR 粒徑最小，因此，選用薄膜水化法制備 PEG/DOX/CUR；表 2 是采用不同投料比制備的 PEG/DOX/CUR，結果顯示隨著 PEG用量增多，PEG/DOX/CUR粒徑、分散系數(shù)逐漸降低，包封率逐漸增高；投料比為1:1:7和1:1:8 時，粒徑、電位及包封率基本無差別，但 1:1:8 的投料比制備的 PEG/DOX/CUR PDI較大，可能是由于過多的 PEG形成了未包裹藥物的較小空白納米顆粒，增大了 PDI，另外，增加 PEG 用量也存在毒性增加的風險，因此，本研究選取 1:1:7 的投料比進行后續(xù)實驗；表 3 為投藥濃度對 PEG/DOX/CUR 制備的影響，結果顯示，投藥濃度為 0.5 mg/mL時各項

圖 3 核磁氫譜。a為 CUR核磁氫譜，b 為 DOX核磁氫譜；c 為 PEG/DOX/CUR 核磁氫譜。3.1.5 PEG/DOX/CUR 紫外及熒光光譜圖 4是 PEG/DOX/CUR 的紫外及熒光光譜，結果顯示包載了 CUR 和 DOX的PEG/DOX/CUR 在 500 nm-600 nm 處有一個較寬的熒光發(fā)射峰，是 CUR 和 DOX 內在熒光性質所致，為直接使用熒光顯微鏡觀察細胞攝取及內吞機制提供了基礎。

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2744733