【摘要】：目的1.采用原子力顯微鏡分子級成像技術從單分子水平研究神經(jīng)系統(tǒng)關鍵蛋白survivin與抗體的相互作用,在接近蛋白自然條件下揭示其三維結構和作用域,以便我們更直觀理解survivin在膠質瘤發(fā)生和神經(jīng)損傷恢復中的分子作用機制及作用。2.選取腫瘤細胞凋亡抑制蛋白survivin,在近生理環(huán)境中使之與稀土離子鈰(Ce~(3+))發(fā)生作用;再通過原子力顯微鏡(AFM)對目標物的精細結構進行成像;實現(xiàn)在單分子水平上研究稀土小分子與目標物的作用域。揭示稀土對抑制凋亡關鍵蛋白的作用方式與腫瘤細胞凋亡間的內在聯(lián)系。方法1.選取survivin蛋白,高純水稀釋至0.2 ng/mL,survivin兔多克隆抗體稀釋至400 ng/mL,取5μL 0.04 ng/mL的survivin蛋白滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測;取5μL 40 ng/mL的survivin兔多克隆抗體滴到云母片上靜置制樣后用AFM觀測;用微量移液器取20μL 0.2ng/mL的survivin蛋白,取10μL 400 ng/mL的survivin抗體,加70μL高純水稀釋后,振搖2 min后分別在25℃,37℃,45℃下孕育相應時間后,取5μL survivin蛋白和survivin抗體的混合液滴到云母片上靜置制樣后用AFM觀測。樣品檢測都采用AFM的敲擊模式。2.選取survivin蛋白,高純水稀釋至0.2 ng/mL,選取鈰標準溶液分別稀釋至100μg/mL和10μg/mL,用微量移液器取5μL 0.02 ng/mL的survivin蛋白滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測;取5μL 10μg/mL的Ce~(3+)水溶液滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測;用微量移液器取10μL 0.2 ng/mL的survivin蛋白,用微量移液器取相應體積的100μg/mL或10μg/mL的Ce~(3+)水溶液,加適量高純水稀釋后,配成所需濃度的溶液,振搖2 min后分別在25℃,37℃,45℃下孕育相應時間后,用微量移液器取5μL survivin蛋白和Ce~(3+)的混合液滴到新剝離的云母片上靜置制樣后用AFM觀測;樣品檢測都采用AFM的敲擊模式。結果1.對survivin蛋白同源二聚體的原子力顯微鏡觀測表明:在水溶液中survivin蛋白主要以7-8 nm大小的分散體存在,高分辨AFM圖可以清晰地看到survivin蛋白的結構域和兩個α螺旋。2.抗體三維結構的高分辨AFM圖像表明:Y形結構的IgG分布在球狀結構的牛血清白蛋白之中,在AFM圖中二者可以通過結構差異很容易區(qū)分。高分辨AFM圖揭示IgG的三個相對獨立并且有柔性鏈鏈接的Y型復合結構,可以獲得Ig G更細節(jié)的結構域。3.溫度對survivin蛋白與survivin蛋白抗體相互作用的影響不同,25℃時survivin-抗體結合單元的三區(qū)域組合成的Y形結構和球形或心形的粒子;37℃時除了可以發(fā)現(xiàn)Y形survivin-抗體結合單元外,還有單個的球形BSA;45℃時很多長短不同的鏈狀結構大量出現(xiàn),單個BSA蛋白的結構也變得松散。高分辨AFM圖表明在45℃下,survivin-抗體結合單元只有局部還保持二級結構,整體已經(jīng)成為鏈狀,周圍分布了各種長短的鏈狀結構。4.溫度對survivin蛋白結構的影響不同,25℃下蛋白團聚比較嚴重;37℃下6-8 nm大小的粒子明顯增多,小粒子和大粒子數(shù)目明顯減少;45℃下溶液中5-12 nm粒子總數(shù)減少明顯,且不再看到溶液中有大于15 nm的大粒子存在,粒子間邊界比較明顯,蛋白有破損,有鏈狀結構形成;37℃下survivin蛋白更多以6-8 nm的雙粒子結合體形式存在;45℃下Ce~(3+)在云母片上形成10 nm左右的大小均勻,邊緣光滑的結晶形結構。5.不同Ce~(3+)濃度對survivin蛋白結構的影響不同,37℃下survivin蛋白在水溶液中大部分得到均勻分散,粒子的邊緣能觀察到伸出的側鏈結構,經(jīng)過1μg/mL的Ce~(3+)作用后,粒子聚集為更大一些的較為均勻的粒子,粒子的邊緣具有類似絨毛的側鏈結構;經(jīng)過5μg/mL的Ce~(3+)作用后的粒子總數(shù)增多,一些更的大粒子開始出現(xiàn),粒子邊緣開始變平滑,類似絨毛的側鏈結構不再清晰,10μg/mL的Ce~(3+)作用后的survivin蛋白粒子繼續(xù)變大,粒子邊緣更為平滑緊致,小粒子變得松散,有少量的線裝肽段出現(xiàn);50μg/mL的Ce~(3+)作用后有更大的粒子組合形成,基底出現(xiàn)規(guī)則的硝酸鈰結晶的堆集。6.Ce~(3+)與survivin蛋白作用不同時間和不同溫度對其結構的影響不同,survivin蛋白與Ce~(3+)在25℃下作用10 min后,在水溶液中形成大小不等的粒子,作用20 min后,在水溶液中8-10 nm大小的粒子明顯增多,超過5-9 nm的粒子占據(jù)主要地位,20-30 nm的團聚也有所增多,作用30 min后形成了更多的形態(tài)各異的大的組合,有的超過60 nm,在37℃下作用10,20和30 min后具有類似的變化,在45℃下隨著作用時間的增加,聚合增多,并伴隨結構的改變和破碎肽段的出現(xiàn)。結論1.適宜溫度對蛋白三級結構保持的重要性,結果表明survivin蛋白與抗體的結合在37℃比較適宜,這樣既能防止低溫下的團聚作用又能避免高溫對其三級結構的破壞。2.低溫對survivin蛋白大團聚的分散不利,低溫有助于保持survivin蛋白以單體的形式存在,不利于二聚體的快速形成。較高的溫度能快速分散原來存在的團聚物,但其副作用是對survivin蛋白三級結構有一定程度的破壞,三級結構展開成肽鏈。在37℃接近生理條件的環(huán)境下,這兩種影響能更好的得到平衡。3.低濃度Ce~(3+)對survivin蛋白功能有兩個方面的影響:一是通過四聚體的形成減少溶液中survivin蛋白的密度,二是通過使溶液中的survivin二聚體解聚為survivin單體減少溶液中survivin蛋白的有效密度,高濃度Ce~(3+)對survivin蛋白功能的影響主要是抑制和損壞:除了通過聚合作用減少溶液中survivin蛋白的有效密度,還存在對其功能域的改變和破壞。4.時間的影響表現(xiàn)在:隨時間的增加,Ce~(3+)連接survivin蛋白二聚體成為更大的結構,多聚體數(shù)量增加。溫度影響表現(xiàn)在兩方面:一方面溫度能加速Ce~(3+)對survivin蛋白的聚合過程,另一方面溫度能增加Ce~(3+)對survivin蛋白三級結構的改變和破壞作用。較低溫度下以survivin蛋白二聚體向survivin蛋白多聚體轉化為主;在近生理溫度下,一方面也存在上述的這種單向聚合過程,而且這種過程由于溫度的適宜變得更快,在短時間內能完成survivin蛋白二聚體向多聚體的轉變,除此之外還存在Ce~(3+)對survivin蛋白結構的改變和survivin蛋白多聚體的解聚;在較高溫度下,Ce~(3+)不僅能改變survivin蛋白的三級結構,而且能對肽鏈造成損壞,使之部分成為肽段。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

29第一部分 附圖圖1.1. 溶液中的survivin蛋白二聚體結構的高分辨AFM圖a-c) 分別以worms , space fill和 ball and stick方式表示的survivin蛋白二聚體的三維結構圖（PDB ID: MMDB_1XOX）， d) Survivin蛋白的AFM圖, e) 放大的survivin蛋白的AFM圖(d圖紅色框選定區(qū)域), f) Survivin蛋白的高分辨AFM圖(e圖中紅色框選定survivin蛋白)，內圖為以wire方式表示的survivin抗體的三維結構圖(來源于MMDB_1XOX)， g)大范圍survivin蛋白分布的AFM圖, h) Survivin蛋白的粒子分布柱狀圖, i) 粒子長，寬與粒子等面積圓直徑的相互關系圖。

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文31圖1.2. 溶液中的survivin抗體與BSA結構的高分辨AFM圖a)以 worms 方式表示的 survivin 抗體的 X 射線晶體學數(shù)據(jù)三維結構圖(來源于 MMDB_1IGT)，b)以 worms 方式表示的 BSA 的 X 射線晶體學數(shù)據(jù)三維結構圖 (來源于 MMDB_4ORO)， c)溶液中分布的 survivin 抗體與 BSA 的大范圍掃描的 AFM 圖, d) 選定的 survivin 抗體的高分辨 AFM 圖(c 圖中紅色框選定區(qū)域)，內圖為以 wire 方式表示的 survivin 抗體的三維結構圖(來源于 MMDB_3CM9), e) BSA 的高分辨 AFM 圖(c 圖中綠色框選定區(qū)域)，內圖為以 ball andstick 方式表示的 BSA 晶體的三維結構圖(來源于 MMDB_4ORO), f) Survivin 抗體 IgG 的三維立體圖。

【參考文獻】

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本文編號：2741054