發(fā)布時間：2020-07-03 10:09

【摘要】：研究背景與目的腦膠質(zhì)瘤是成人最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,目前各種治療療效均不理想。尋找和研究調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的相關(guān)基因?qū)⒂兄谶M一步揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理,為其基因治療提供理想可靠的治療靶標。microRNAs是一類長度為19-25個核苷酸內(nèi)源性非編碼的小分子單鏈RNA,研究表明,miR-130a可作為膠質(zhì)瘤患者預后的預測指標。但其在膠質(zhì)瘤中的體內(nèi)功能及其作用機制尚未明確。高遷移率族蛋白-2屬于HMG蛋白家族,其通過促進細胞增殖、侵襲和化療耐藥導致膠質(zhì)瘤患者的預后差。本研究通過檢測miR-130a在膠質(zhì)瘤中的表達,并采用慢病毒構(gòu)建miR-130a穩(wěn)定過表達膠質(zhì)瘤細胞株,檢測細胞增殖、侵襲能力的變化以及EMT表型的改變,進一步探討miR-130a介導的分子機制,同時研究EZH2抑制miR-130a轉(zhuǎn)錄的分子機制,為發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤治療新靶點提供依據(jù)。研究內(nèi)容與方法1.膠質(zhì)瘤中miR-130a基因表達特性的鑒定利用qRT-PCR檢測膠質(zhì)瘤細胞株及不同級別腫瘤組織中miR-130a的表達水平。2.miR-130a在膠質(zhì)瘤中的功能初步研究用慢病毒構(gòu)建miR-130a穩(wěn)定過表達的膠質(zhì)瘤細胞株將膠質(zhì)瘤細胞U87中的miR-130a過表達,同時以si-Scrambled片段作為陰性對照。利用RT-PCR檢測miR-130a過表達的效率。用噻唑藍比色(MTT)實驗檢測miR-130a對膠質(zhì)瘤細胞增殖功能的影響;運用平板克隆實驗驗證miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細胞克隆形成的能力;運用Boyden小室侵襲實驗檢測miR-130a可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲;采用裸鼠皮下成瘤實驗驗證miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。3.miR-130a介導的分子機制初步研究miR-130a過表達后抑制了細胞的侵襲能力,故通過免疫熒光定性檢測細胞侵襲相關(guān)的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、微絲蛋白的表達;通過Western blot定量檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達。由于過表達miR-130a后,細胞出現(xiàn)G1期向S期轉(zhuǎn)化障礙并抑制細胞增殖,利用Western blot定量檢測與細胞周期G1/S期相關(guān)的CDK4、c-myc、CyclinD1蛋白的表達。生物信息學軟件預測HMGB2可能為miR-130a的直接靶基因,采用熒光定量PCR和Western blot驗證過表達miR-130a可以抑制HMGB2的表達;雙熒光素酶報告基因驗證miR-130a可以靶向結(jié)合HMGB2 mRNA的3'UTR區(qū)域進而抑制HMGB2基因的表達;MTT實驗和克隆形成實驗驗證miR-130a通過靶向HMGB2抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖;Boyden小室侵襲實驗檢測miR-130a通過靶向HMGB2來抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。4.EZH2抑制miR-130a轉(zhuǎn)錄的分子機制研究利用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法檢測細胞DNA甲基化水平;信息學分析EZH2可以結(jié)合miR-130a的啟動子區(qū)域序列;染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在體內(nèi)進一步驗證EZH2與miR-130a啟動子區(qū)域結(jié)合;用RNA干擾技術(shù)將膠質(zhì)瘤細胞U87中EZH2沉默表達,利用RT-PCR檢測U87中miR-130a表達水平;進一步采用阿糖胞苷處理U87后檢測miR-130a的表達水平。結(jié)果在膠質(zhì)瘤中miR-130a的表達下調(diào)且過表達miR-130a能抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲能力。動物體內(nèi)進一步驗證了 miR-130a抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。生物信息學分析提示HMGB2 mRNA的3'UTR含有miR-130a直接作用的靶序列,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進一步驗證該靶序列能與miR-130a結(jié)合,組織及細胞水平進一步驗證miR-130a對HMGB2蛋白表達的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平;過表達HMGB2能逆轉(zhuǎn)miR-130a對膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的抑制。EZH2通過組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(H3K27me3)來抑制miR-130a的表達。結(jié)論:miR-130a在膠質(zhì)瘤中的表達降低;HMGB2介導了 miR-130a對膠質(zhì)瘤惡性生物學行為的抑制,miR-130a的表達受EZH2調(diào)控。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41
【圖文】：

熒光定量ＰＣＲ檢測６２例膠質(zhì)瘤腫瘤組織和１５例正常腦組織中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑的表達水平，結(jié)果顯示：與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織組中ｍｉＲ－１３０ａ的表達水逡逑平低于正常腦組織（圖１－２）。（縱坐標值代表２＿Ａａ值）逡逑＜0逡逑吾邐８－逡逑全邐？逡逑Ｅ邐Ｋ逡逑１－邐＋逡逑ｇ邋Ｓ逡逑１－Ｓ邋４－逡逑ｇ－ｉ邐N逡逑Ｉ邐0ｌ邐，邐十Ｘ逡逑Ｓ．邐ＮＢＣ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｒａｄｅ逡逑ＩＩ邐ＩＩＩ邐ＩＶ逡逑圖１－２膠質(zhì)瘤腫瘤組織中ｍｉＲ－１３０ａ的表達水平。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ａｓｓａｙ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ邋ｔｈａｔ邋ｍｉＲ－１３０ａ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ逡逑ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋ｉｎ邋ｇｌｉｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝６２）邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅｓ（ｎ＝１５）．逡逑四、結(jié)論逡逑本節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１３０ａ在膠質(zhì)瘤腫瘤組織和細胞系中表達下調(diào)，逡逑ｍｉＲ－１３０ａ的表達與腫瘤的病理級別呈相關(guān)性。逡逑２４逡逑

胞數(shù)鋪到９６孔板中，然后分別在轉(zhuǎn)染后１邋ｄａｙ、２邋ｄａｙｓ、３邋ｄａｙｓ、４邋ｄａｙｓ、５邋ｄａｙｓ、６邋ｄａｙｓ逡逑加入ＭＴＴ溶液，應用酶標儀檢測其在４５０ｎｍ處的ＯＤ值，結(jié)果顯示Ｕ８７中ｍｉＲ－１３０ａ逡逑過表達組在不同時間點的ＯＤ值均比對照組降低（圖２－２），這表明ｍｉＲ－邋１３０ａ對膠質(zhì)逡逑瘤細胞的生長有抑制作用。逡逑0邋－Ｉ邋ＬＶ－ｃｔｒｌ邐ＬＶ－ｍｉＲ－１３０ａ逡逑0邋－邐Ｊｇ，逡逑ＩＩ－逡逑Ｏ邋0逡逑ＣＴ３邋ｏ邋－邐＾逡逑0邋Ｉ邐，邐，邐，邐｜邐｜邐＾逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７逡逑Ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｉｍｅ（ｄａｙ）逡逑４３逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 謝強;黃作平;閆雍容;李鋒;鐘雪云;;miR-221調(diào)控PTEN/Akt信號介導人膠質(zhì)瘤耐藥細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2014年02期

2 崔秀英;郭運杰;姚和瑞;;耐藥乳腺癌細胞株MCF-7/ADR中microRNA的分析[J];南方醫(yī)科大學學報;2008年10期

本文編號：2739524