【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一類主要影響運動系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病,在60歲以上人群的患病率高達1%。據(jù)統(tǒng)計,2015年全球范圍存在約620萬名PD患者。PD最主要的病理特征為大腦基底神經(jīng)節(jié)中的多巴胺能神經(jīng)元死亡以及神經(jīng)細胞內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性的細胞質(zhì)包涵體(路易體,Lewy bodies)。路易體是由α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)形成的纖維狀聚集物組成的腦部蛋白質(zhì)淀粉樣沉積。α-Syn是一種SNCA基因編碼的由140個氨基酸組成蛋白,主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細胞的突觸前末端中,占腦部細胞質(zhì)總蛋白量的1%左右。天然狀態(tài)下,α-Syn在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),作為分子伴侶參與SNARE復(fù)合物的形成,在神經(jīng)元高爾基體的運作和囊泡運輸中起到重要作用。病理條件下,α-Syn發(fā)生錯誤折疊,分子間相互結(jié)合形成毒性聚集中間體,最終形成富含b-折疊結(jié)構(gòu)的線形纖維沉積于腦部。在部分家族性PD病例中發(fā)現(xiàn)了幾種α-Syn的單氨基酸突變體,如A18T、A29S、A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T,這些病理突變體的聚集性與毒性與野生型α-Syn不盡相同,其導(dǎo)致PD發(fā)生的機理仍未研究清楚。α-Syn在體內(nèi)經(jīng)歷一系列翻譯后修飾,如磷酸化、硝基化、泛素化、蛋白酶解等。其中,蛋白酶解一般發(fā)生在α-Syn的C端,約有10-30%的α-Syn在PD患者腦部的路易體內(nèi)以C端截短形式出現(xiàn)。神經(jīng)退行性疾病常伴隨有慢性的神經(jīng)炎癥,研究報道神經(jīng)炎癥中的重要調(diào)節(jié)因子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)可在121位天冬氨酸與122位天冬酰胺之間剪切α-Syn,生成C端19個氨基酸缺失的截短蛋白α-Syn 1-121(α-Syn121)。抑制Caspase-1對α-Syn的剪切能夠降低炎癥因子誘導(dǎo)的細胞死亡,同時能夠緩解多系統(tǒng)萎縮模型小鼠的行為障礙及腦部α-Syn蛋白沉積。因此,Caspase-1以及α-Syn121在PD的發(fā)生與發(fā)展中可能起到重要作用。此外,研究表明PD患者腦部路易體內(nèi)出現(xiàn)金屬離子(如銅離子)的異常蓄積,銅離子可通過芬頓反應(yīng)催化氧分子生成活性氧,對細胞和組織造成損傷。α-Syn全長被報道通過絡(luò)合銅離子抑制活性氧的產(chǎn)生,其結(jié)合位點主要位于α-Syn N端1-9氨基酸片段及50位組氨酸。在本論文中,我們對α-Syn及其病理突變體A18T、A29S、A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T全長以及相應(yīng)121截短蛋白的聚集性、膜毒性以及細胞毒性進行了一系列研究。同時我們還研究了α-Syn及其病理突變體全長和相應(yīng)的121截短蛋白影響銅離子催化活性氧產(chǎn)生的能力。在本論文的第二章,硫黃素T熒光實驗、細胞毒性實驗以及染料泄漏實驗結(jié)果表明α-Syn121的聚集速度和細胞毒性較α-Syn全長顯著性增強,但破膜能力減弱。透射電子顯微鏡與傅里葉變換紅外光譜的實驗結(jié)果進一步顯示α-Syn121形成以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主的無定型聚集物,而α-Syn全長形成以b折疊結(jié)構(gòu)為主的線形纖維。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗與活性氧產(chǎn)生實驗結(jié)果表明α-Syn121形成的無定型聚集物能夠通過激活凋亡通路以及誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生導(dǎo)致細胞死亡。此外通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗與免疫熒光實驗,我們觀察到外源的α-Syn121聚集物可促使細胞內(nèi)Caspase-1活化,剪切內(nèi)源α-Syn生成α-Syn121,促進細胞內(nèi)α-Syn蛋白的沉積。在本論文的第三章,硫黃素T熒光實驗、細胞毒性實驗以及染料泄漏實驗結(jié)果表明,與各種α-Syn病理突變體全長相比,相應(yīng)的121截短蛋白的聚集性和細胞毒性同樣顯著性增強,但破膜能力減弱�？箟难猁}損耗實驗、香豆素3-羧酸氧化實驗以及Amplex紅氧化實驗結(jié)果顯示,所有的121截短蛋白抑制銅離子催化產(chǎn)生活性氧的能力和相應(yīng)全長蛋白相比均顯著性降低。本論文研究結(jié)果顯示,天然存在的α-Syn C端截短蛋白α-Syn121聚集性及細胞毒性均顯著性強于α-Syn全長,并且α-Syn121的聚集物能夠刺激Caspase-1剪切α-Syn全長產(chǎn)生α-Syn121,形成更多細胞內(nèi)α-Syn聚集物沉積并進一步激活Caspase-1,導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡,該惡性循環(huán)可能在PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外,本論文研究結(jié)果表明,C端122-140片段在α-Syn與銅離子的結(jié)合中發(fā)揮重要作用,121截短蛋白抑制銅離子產(chǎn)生活性氧的能力較相應(yīng)α-Syn全長顯著性降低。我們的研究結(jié)果提示Caspase-1以及α-Syn121之間的惡性循環(huán)可能在PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,靶向清除或抑制Caspase-1及α-Syn121的策略對PD具有潛在的治療效果。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R741
【圖文】：

圖 1. （A）William Richard Gowers 關(guān)于帕金森病的插圖，刊登于 1886 年的 神經(jīng)系統(tǒng)疾病手冊 ，來自維基百科 Parkinson's disease 詞條；（B）PD 患者腦部黑質(zhì)區(qū)路易體放大不同倍數(shù)的照片，來自于維基百科 Lewy body 詞條。1.3 路易體1912 年，F(xiàn)ritz Jakob Heinrich Lewy 描述了帕金森病患者腦部出現(xiàn)嗜酸性的細胞內(nèi)沉積，Konstantin Nikolaevich Tretiakoff 于1919年將其命名為路易體（Lewybodies）[25]。根據(jù)路易體的形態(tài)可將其分為腦干和皮質(zhì)類型，腦干型路易體為球形結(jié)構(gòu)，直徑為 8-30 m，透明核心被外圍的淺色暈圈環(huán)繞，并由 7-20 nm 寬的纖維組成，具有致密的顆粒狀物質(zhì)和囊狀結(jié)構(gòu)；皮質(zhì)類型定義尚不明確，缺乏暈圈，形狀為紡錘狀或線狀，一般出現(xiàn)在受影響神經(jīng)元的軸突和樹突中（圖 1B）[26]。1997 年，Spillantini, M. G. 等人發(fā)現(xiàn)存在于散發(fā)性 PD 患者腦部的路易體對 -突觸核蛋白具有強烈的免疫反應(yīng)性，確定了 -突觸核蛋白為路易體的主要成分

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文研究發(fā)現(xiàn) -Syn 廣泛定位于哺乳動物大腦神經(jīng)元的細胞核中，表明 -Syn 在細胞核中起作用[32]。 -Syn 通過結(jié)合囊泡相關(guān)膜蛋白 2（Vesicle-associatemembrane protein 2，VAMP2）調(diào)節(jié)可溶性 NSF 附著蛋白受體（Soluble NSattachment protein receptor，SNARE）復(fù)合物組裝，促進突觸前末端的突觸小泡融合[33]。 -Syn 在神經(jīng)元高爾基體的運作和囊泡運輸中也起到重要作用[34]。同時 -Syn 對于認知功能的正常發(fā)育是必不可少的，研究表明 -Syn 敲除小鼠在空間學(xué)習(xí)和工作記憶上嚴重受損[35]。

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本文編號：2735469