發(fā)布時(shí)間：2020-06-23 01:53

【摘要】：背景:研究表明,長(zhǎng)期應(yīng)激條件的刺激可以引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的異常行為并增加了人類患心理疾病的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外,應(yīng)激環(huán)境的慢性刺激會(huì)加速大腦老化,記憶力衰減并最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素是下丘腦-垂體-腎上腺軸受應(yīng)激刺激時(shí)分泌的主要激素,糖皮質(zhì)激素類作為臨床治療藥物在臨床上的使用也非常廣泛,尤其是用于對(duì)自身免疫性疾病和部分內(nèi)分泌疾病的患者,這些患者均會(huì)有長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的需求。研究表明應(yīng)激激素皮質(zhì)醇的升高和人類衰老過程中顳葉萎縮以及認(rèn)知缺陷密切相關(guān),另外臨床數(shù)據(jù)表明伴有皮質(zhì)醇水平升高的患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和記憶衰退的癥狀早于同齡對(duì)照組患者。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素類藥物如地塞米松可損傷人類或嚙齒類動(dòng)物的記憶能力增加人體患神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病患者(如阿爾茲海默爾癥患者)體內(nèi)皮質(zhì)醇水平高于同齡組皮質(zhì)醇平均水平,目前文獻(xiàn)報(bào)道的長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素增加患神經(jīng)退行性疾病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制包括腦神經(jīng)分泌因子的減少、氧化應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn),以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)功能的改變。值得注意的是目前臨床上尚沒有發(fā)現(xiàn)有效對(duì)抗這種神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物,一是由于中樞神經(jīng)細(xì)胞具有不可再生性的特點(diǎn);二是由于目前大部分被發(fā)現(xiàn)的具有神經(jīng)保護(hù)性的物質(zhì)都是大分子物質(zhì)或者非脂溶性物質(zhì),無法通過血腦屏障。五味子(Schisandra chinensis,SCH)屬于木蘭科植物,五味子作為傳統(tǒng)中藥藥材具有增強(qiáng)智力和改善心理的作用,常用于治療病毒性肝炎、化學(xué)性肝炎以及心肌疾病。五味子發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用、抗氧化反應(yīng)作用的主要成分是聯(lián)苯環(huán)辛二烯木脂素。五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲是從五味子中提取的主要有效成分,通過結(jié)構(gòu)分析得知五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲均是聯(lián)苯環(huán)辛二烯衍生物。五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素作為小分子脂溶性物質(zhì)可以通過血腦屏障,五味子中的這種小分子結(jié)構(gòu)為其可作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用藥物提供了支持。從動(dòng)物模型體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中證明,無論對(duì)由東莨菪堿引起的健忘癥,淀粉樣β樣蛋白引起的神經(jīng)毒性、順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激傷害還是基因表達(dá)異常引起的神經(jīng)毒性,五味子醇甲表現(xiàn)有神經(jīng)保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道五味子醇甲作為五味子果實(shí)中的主要活性成分具有安定、抗驚以及腦保護(hù)作用;然而,五味子醇甲對(duì)抗糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷其可能的作用機(jī)制尚不明確。因此研究五味子醇甲在改善糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷中的作用機(jī)制具有重要的研究?jī)r(jià)值。目的:通過體外實(shí)驗(yàn)探討五味子醇甲是否對(duì)糖皮質(zhì)激素所致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用,并發(fā)現(xiàn)其可能的作用機(jī)制,為臨床治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供理論依據(jù)。方法:實(shí)驗(yàn)從新生24小時(shí)以內(nèi)的SD大鼠的腦組織皮層中提取神經(jīng)元,體外培養(yǎng)3天,觀察神經(jīng)元突起生長(zhǎng)狀況;通過NSE實(shí)驗(yàn)和MAP2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)對(duì)提取的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步確認(rèn)神經(jīng)元的形態(tài)及純度,以及不同規(guī)格的培養(yǎng)皿的最優(yōu)細(xì)胞種植密度;提取的神經(jīng)元每三天換一次液,體外培養(yǎng)9天后,將神經(jīng)元分為對(duì)照組和地塞米松處理組;用不同濃度的地塞米松(10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~-77 mol/L)繼續(xù)作用神經(jīng)元3天,MTT實(shí)驗(yàn)鑒定地塞米松處理過的神經(jīng)元的活性;結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)PCR技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù),檢測(cè)分組的神經(jīng)元MAP2 mRNA的表達(dá)差異以及觀察神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)狀態(tài),最終確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中采取的地塞米松藥物的適宜濃度。提取的神經(jīng)元經(jīng)過9天的體外培養(yǎng)后,將神經(jīng)元分為對(duì)照組、地塞米松損傷組以及地塞米松損傷加不同濃度(40、80和160μmol/L)的五味子醇甲處理的實(shí)驗(yàn)組,繼續(xù)培養(yǎng)三天;提取神經(jīng)元的蛋白和RNA,通過western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)探尋五味子醇甲對(duì)損傷的神經(jīng)元可能的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。結(jié)果:1原代神經(jīng)元經(jīng)過3天的體外培養(yǎng),根據(jù)觀察到的神經(jīng)突起生成情況,MAP2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和NSE染色鑒定神經(jīng)元的純度和生長(zhǎng)狀態(tài),發(fā)現(xiàn)接種神經(jīng)細(xì)胞最優(yōu)的密度為6孔板為100萬/孔,12孔板為25萬/孔,24孔板為8萬/孔,96孔板為4萬/孔。MTT結(jié)果地塞米松處理72小時(shí)后,10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松處理組的神經(jīng)元的存活率降低,MAP2抗體免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示神經(jīng)元的突起在10~(-4)和10~-55 mol/L的地塞米松處理的情況下,神經(jīng)元神經(jīng)纖維纏結(jié)明顯,部分神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)甚至崩解。所以確定有效的損傷濃度是10~(-4)和10~(-5)mol/L的地塞米松;在10~(-6)和10~-77 mol/L低濃度地塞米松處理濃度處理的情況下神經(jīng)突起纏繞不明顯,不能有效的損傷神經(jīng)元。2神經(jīng)元體外培養(yǎng)9天后,同時(shí)加入地塞米松和五味子醇甲,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神經(jīng)元存活率降低;MAP2免疫熒光染色結(jié)果顯示加入五味子醇甲后的神經(jīng)元突起纏繞情況得到緩解,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)崩解情況較少。3 western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元突觸后致密蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與空白組和溶劑對(duì)照組相比,地塞米松處理組的神經(jīng)元突觸后致密蛋白PSD95的表達(dá)下調(diào);tau蛋白的磷酸化水平增強(qiáng),tau不同位點(diǎn)(ser199,ser202,ser396)的磷酸化水平升高;實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比較,地塞米松處理組MAP2mRNA的表達(dá)量下降,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GLU3)mRNA的表達(dá)量下降。4在地塞米松作用神經(jīng)元細(xì)胞的同時(shí)加入五味子醇甲作用細(xì)胞三天,Western Blot結(jié)果顯示與地塞米松處理組相比,加入五味子醇甲后神經(jīng)元細(xì)胞的突出后致密蛋白PSD95的表達(dá)增強(qiáng),并表現(xiàn)為一定的五味子醇甲劑量依賴性,tau蛋白磷酸化水平降低,tau蛋白不同位點(diǎn)的抗磷酸化水平增強(qiáng);實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與地塞米松作用組相比較,五味子醇甲的加入可使神經(jīng)元細(xì)胞MAP2 mRNA的表達(dá)量上調(diào),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3的mRNA表達(dá)量增強(qiáng)。結(jié)論:五味子醇甲對(duì)糖皮質(zhì)激素引起的神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用,其可能機(jī)制一是使神經(jīng)元膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3 mRNA的表達(dá)上調(diào),加速葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),為tau蛋白糖基化提供更多的底物,提高tau蛋白的糖基化水平,從而降低tau蛋白磷酸化水平;二是五味子醇甲通過增加突觸周致密蛋白PSD95的表達(dá)量對(duì)神經(jīng)元的突觸有一定的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741
【圖文】：

糖皮質(zhì)激素和記憶的倒U型劑量反應(yīng)曲線圖，虛線所指計(jì)量為最佳的鞏固記憶的糖皮質(zhì)激素水平，注意這個(gè)峰值可能會(huì)根據(jù)記憶的類型和階段和個(gè)體差異而改變

圖 2：糖皮質(zhì)激素促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病發(fā)生可能的慢性作用機(jī)制。五味子屬有大約 30 個(gè)種類，五味子為其中的一種是多年生植物，主要生長(zhǎng)在韓國(guó)東北地區(qū)、中國(guó)、日本以及俄羅斯的東部地區(qū)[15]。五味子是一個(gè)重要的藥用植物，在統(tǒng)的藥物中，五味子的果實(shí)一直被用于治療多種機(jī)體功能紊亂癥狀，包括腎臟感染、

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10 初洪波;車q

本文編號(hào)：2726602