【摘要】：背景:腦卒中已成為危害人類健康及生存質(zhì)量的主要殺手。在中國,腦卒中已成為全疾病順位死亡原因的首位。缺血性腦卒中占全部腦卒中的80%以上,具有高患病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率的四高特征。腦卒中是一個可防、可控的疾病。除了對原發(fā)疾病控制外,還需要對卒中發(fā)生及發(fā)展給與有效防控措施。遠隔預(yù)處理作為一種新興的缺血/再灌注損傷的保護手段,引起了神經(jīng)科學(xué)的重視。本研究旨在證實遠隔缺血預(yù)處理(Remote Ischemic preconditioning,RIPrC)對神經(jīng)系統(tǒng)缺血/再灌注損傷的保護作用,并在此基礎(chǔ)之上,系統(tǒng)研究和分析其神經(jīng)保護作用機制。缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IP)也稱缺血預(yù)適應(yīng),是指通過一次或多次短暫性、亞致死性的缺血/再灌注,誘導(dǎo)啟動組織或細胞內(nèi)源性保護機制,從而提高組織對致死性缺血損傷耐受力,降低損傷程度,減少損傷范圍。遠隔缺血預(yù)處理是指利用一個器官或組織的短暫缺血/再灌注可以通過在循環(huán)中釋放生化信使或激活神經(jīng)通路而對遠隔器官的缺血性損傷產(chǎn)生保護作用。RIPrC對受保護的靶器官無創(chuàng)傷且不產(chǎn)生直接應(yīng)激,因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。RIPrC的確切作用機制目前尚不清楚,研究認為直接缺血預(yù)處理時保護信息在同一器官中傳遞,而RIPrC時將保護信息傳遞到遠隔器官。信息的傳遞可能通過體液介質(zhì)、神經(jīng)通路或聯(lián)合作用介導(dǎo)。我們部分前期工作發(fā)現(xiàn)在腦梗死患病后,經(jīng)過遠隔缺血后處理后,外周的血液內(nèi)一些炎癥細胞及炎癥因子有不同程度的變化,這些變化伴隨著患者的神經(jīng)功能的改善,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血/再灌注損傷起到保護作用。因此我們推測,遠端缺血處理可能通過影響機體免疫功能作用于中樞。目的:證實RIPrC對小鼠MCAO模型的缺血及再灌注腦損傷的保護作用;RIPrC對正常小鼠外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能的影響;通過RIPrC對腦缺血及再灌注損傷后中樞及外周免疫功能的調(diào)控,探索出免疫調(diào)控相關(guān)的細胞信號傳導(dǎo)通路,最終探索出RIPrC通過影響中樞及外周免疫功能達到保護作用。方法:實驗動物采用8-10周齡的成年健康雄性C57/BL6小鼠,體重20-25g;RIPrC采用左下肢血流阻斷15min后血液復(fù)流15min為一個周期,共實施3個周期,24小時后實施MCAO;線栓法制作小鼠MCAO模型;激光多普勒血流儀監(jiān)測下肢血流是否阻斷及測定MCAO后腦血流下降程度;TTC染色觀察腦梗死體積;Longa評分測定神經(jīng)功能,角落試驗(the corner test)和除膠試驗(the adhesive tape removal test)評價行為學(xué);質(zhì)譜流式細胞術(shù)測定外周血免疫細胞及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵因子。結(jié)果:(1)MCAO小鼠造模后角落實驗轉(zhuǎn)向健側(cè)肢體幾率明顯增高,去膠帶時間明顯延長,而在造模前實施了RIPrC,角落試驗轉(zhuǎn)向健側(cè)肢體幾率明顯降低,去膠帶時間明顯縮短,同時Longa評分也有所好轉(zhuǎn),腦梗死體積明顯縮小,說明RIPrC可明顯改善腦缺血后運動神經(jīng)功能損傷及縮小腦梗死體積。(2)遠隔缺血處理后,質(zhì)譜流式的檢測結(jié)果為正常小鼠在外周血中,中性粒細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)量較對照組有所增加,單核細胞、B細胞、Eff/mem CD4+T細胞和Eff/mem CD8+T細胞以及中性粒細胞的變化趨勢為先明顯減少再增加。在顱內(nèi),中性粒細胞、B細胞、Eff/mem CD4+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)量較對照組有所增加,Eff/mem CD8+T細胞以及小膠質(zhì)細胞沒有明顯變化。遠隔預(yù)處理可使p EGFR、i NOs在CD4+T細胞、Eff/mem CD4+T細胞以及中性粒細胞中的表達減少,而在CD8+T細胞以及Eff/mem CD8+T細胞中表達明顯增多。p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3、IRF4和Arg-1在五種細胞內(nèi)表達均明顯減少。在顱內(nèi)小膠質(zhì)細胞中,遠隔預(yù)處理后p EGFR和Arg-1明顯增加,p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3以及IRF4明顯減少。(3)RIPrC后,質(zhì)譜流式的檢測結(jié)果為,MCAO小鼠RIPrC激活腦缺血及再灌注損傷后外周的免疫功能,但卻抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng),表現(xiàn)為在外周血中白細胞總數(shù)、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、單核細胞的數(shù)量明顯增加,在顱內(nèi)這些細胞亞群以及小膠質(zhì)細胞的數(shù)量明顯降低。CD4+T細胞、Eff/mem CD4+T細胞、CD8+T細胞、Eff/mem CD8+T細胞、中性粒細胞以及小膠質(zhì)細胞中促炎癥相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵因子p4E-BP1、p STAT4、p STAT1、p STAT3、p-P38、i NOs以及I?Ba在處理后明顯降低,Arg-1在CD4+T細胞、Eff/mem CD4+T細胞、CD8+T細胞、Eff/mem CD8+T細胞、中性粒細胞中降低,而在小膠質(zhì)細胞中則明顯升高。結(jié)論:(1)RIPrC對小鼠MCAO模型的缺血及再灌注腦損傷具有保護作用;(2)遠隔缺血處理可影響正常小鼠外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能,其效應(yīng)細胞主要為CD4+T細胞、Eff/mem CD4+T細胞、CD8+T細胞、Eff/mem CD8+T細胞、中性粒細胞以及小膠質(zhì)細胞,可能影響的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為p EGFR、i NOs、Arg-1、p ERK1-2、p S6、p STAT3、Gata3以及IRF4;(3)通過RIPrC對腦缺血及再灌注損傷后中樞及外周免疫功能的調(diào)控,RIPrC可能通過調(diào)節(jié)p STAT3、i NOs以及Arg-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)CD4+T細胞、Eff/mem CD4+T細胞、CD8+T細胞、Eff/mem CD8+T細胞、中性粒細胞以及小膠質(zhì)細胞的數(shù)量以及狀態(tài),影響MCAO小鼠的免疫環(huán)境,進而對MCAO小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

圖 2.1 分組示意圖Fig2.1 Experimental groups（2）MCAO 模型的建立采用 Longa 線栓法建立 MCAO 模型[62]，具體方法如下：①小鼠稱重，5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，調(diào)整異氟烷濃度為 1.5-2%，用呼吸面罩維持麻醉狀態(tài)；②將小鼠仰臥位固定在解剖手術(shù)臺上，用含潤滑油的眼膏保護小鼠眼睛，用直流電哺乳動物體溫控制器控制其體溫（直腸溫度）在（37.0±0.5)℃，以左側(cè)大腦中動脈為手術(shù)側(cè)，頸部備皮，碘伏、75%酒精棉球依次消毒；③行頸部前正中切口，剪開皮膚，分離皮下組織，暴露鼓泡腺并將其推向兩側(cè)，鈍性分離頸部肌肉筋膜，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉，暴露頸動脈三角；④顯微鑷鈍性分離頸總動脈（common carotid artery, CCA）、頸內(nèi)動脈（intemal

方法9.0.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ ）差分析（OneWayANOVA）和非參數(shù) t-test。P<0.05 為價驗落試驗（thecornertest）評價小鼠感覺運動功能。每只此試驗。15 只雄性 C57/BL6 小鼠隨機分為 3 組，每；②缺血模型組（MCAO 組）；③遠隔預(yù)處理組（RIP0 次，記錄小鼠左轉(zhuǎn)的次數(shù)。

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本文編號：2721487