發(fā)布時間：2020-06-07 08:30

【摘要】：目的:1.利用2條特異性的、高親和力的膠質(zhì)母細胞瘤核酸適體的形成多價核酸適體探針,增強對靶標膠質(zhì)母細胞瘤細胞系T98G的識別靈敏度。2.篩選獲得針對人腦膠質(zhì)瘤分泌的外泌體的高親和力、高特異性的核酸適體,作為一種新型分子探針用于甄定和分選膠質(zhì)瘤外泌體。方法:1.利用本實驗室通過Cell-SELEX技術(shù)篩選獲得的2條膠質(zhì)母細胞瘤細胞系T98G的核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a,利用流式細胞儀鑒定兩條核酸適體的協(xié)同作用,通過熒光共聚焦顯微鏡證明核酸適體對在靶標細胞膜上的共定位作用。同時在血清、腦脊液中檢測核酸適體在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性及結(jié)合能力,進一步考察其實際應用。2.通過差速離心法,分離純化人膠質(zhì)瘤細胞SHG44分泌的外泌體,利用流式細胞儀和透射電鏡驗證其生物學和形態(tài)學特征。利用之前本實驗室通過CellSELEX技術(shù)篩選獲得的人膠質(zhì)瘤細胞系SHG44的核酸適體文庫,以流式細胞儀分析并篩選得到對SHG44外泌體結(jié)合能力最強的核酸適體。通過軟件模擬其二級結(jié)構(gòu),在保留主要莖環(huán)結(jié)構(gòu)的情況下對其進行截短優(yōu)化。選擇其他膠質(zhì)瘤細胞系產(chǎn)生的外泌體,以流式細胞儀分析核酸適體的選擇性。在血清、腦脊液中檢測核酸適體在生理環(huán)境中的結(jié)合力,進一步考察其實際應用。通過胰酶消化實驗核酸適體的靶標性質(zhì),并通過質(zhì)譜技術(shù)檢測其結(jié)合的靶標。結(jié)果:1.核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a之間存在協(xié)同作用,同時結(jié)合于T98G細胞膜上。激光共聚焦可見核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a在細胞膜上部分重疊。在血清、腦脊液中穩(wěn)定性良好,并且能在血清、腦脊液中對靶標細胞保持良好的結(jié)合能力和特異性。2.通過差速離心法分離純化的膠質(zhì)瘤細胞SHG44產(chǎn)生的外泌體,在電鏡下呈現(xiàn)磷脂雙分子層囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑在40-100nm范圍內(nèi)。流式細胞儀可見外泌體特異性蛋白標志物CD63呈陽性表達。以流式細胞技術(shù)分析人膠質(zhì)瘤細胞SHG44核酸適體文庫,其中核酸適體S12親和力和特異性均最佳。通過模擬核酸適體二級結(jié)構(gòu),在保留主要莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前提下對其截短優(yōu)化。37℃條件下,截短的核酸適體S12-4在血清、腦脊液等生理環(huán)境中對靶標依然保持良好的結(jié)合能力和特異性。與預先經(jīng)過胰酶處理的外泌體孵育,S12-4喪失原有的結(jié)合能力。利用修飾了Biotin的核酸適體來初步甄定人膠質(zhì)瘤細胞SHG44外泌體表面的生物標志物。結(jié)論:1.核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a存在協(xié)同作用,并且共定位于細胞膜上,在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性和對靶標細胞的結(jié)合能力良好,可以作為膠質(zhì)母細胞瘤的一種新型分子探針,將在膠質(zhì)母細胞瘤的早期診斷、術(shù)中熒光、監(jiān)測預后、生物標志物甄定等方面發(fā)揮重要作用。2.篩選獲得的膠質(zhì)瘤細胞SHG44外泌體特異性核酸適體S12-4能夠區(qū)分膠質(zhì)瘤細胞SHG44外泌體與其他膠質(zhì)瘤細胞系外泌體,可以作為外泌體分選探針。并且能在生理環(huán)境下依然保持其生理活性。經(jīng)過胰酶消化實驗證明核酸適體S12-4結(jié)合的靶標為蛋白類物質(zhì),初步甄定得到的生物標志物為熱休克蛋白70(HSC70),有望在腦膠質(zhì)瘤早期診斷和腫瘤預后評估等領域發(fā)揮獨特作用。
【圖文】：

加入 300 μL 結(jié)合緩沖液重懸細胞，使細胞保持單測各組細胞與核酸適體結(jié)合后的熒光值。以 Cy5每管分別計數(shù) 10000 個細胞，每組重復三遍。結(jié)果與分析適體 WYZ-41a、WYZ-50a 的協(xié)同作用核酸適體解離常數(shù)（dissociation constant, Kd）， 達到平臺值，，通過流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果可以發(fā)從 100 nM 增加到 200 nM 時熒光強度無明顯酸適體 WYZ-50a 在細胞表面已經(jīng)達到飽和。同 和 100 nM WYZ-41a 的熒光強度明顯增強，說 結(jié)合于靶標細胞 T98G 上的不同靶點，可以形成 T98G 的識別能力。

13圖 1.2 激光共聚焦熒光顯微鏡細胞成像。Cy5 熒光基團標記的 WYZ-41a 和 FITC熒光基團標記的 WYZ-50a 分別或共同與靶標細胞 T98G 和腦正常星形細胞SVGp12 結(jié)合。以同樣帶有兩種熒光基團的隨機序列作為對照。Hochest 染細胞核，核酸適體終濃度 400nM。Fig. 1.2 Fluorescence confocal images of T98G and SVGp12 cells incubated with Cy5-labeled aptamer WYZ-41a and FITC-labeled aptamer WYZ-50a. Fraction of initialLibrary labeled with Cy5 and FITC, which did not bind to T98G cells, were used ascontrol. Column 1 is the Hochest channel, column 2 is the Cy5 channel, column 3 is theFITC channel and column 4 is the overlay of the Cy5 and FITC channels. Cells in row 1,3 were incubated with Initial Library-FITC (control) and Initial Library-Cy5 (control).Cells in row 2, 4 were incubated with aptamer WYZ-41a-Cy5 and aptamer WYZ-50a-FITC. The final concentration of WYZ-41a, WYZ-50a and initial library was 400 nM.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 李詠梅;趙慶歡;;核酸適配體修飾的納米脂質(zhì)體的制備及靶向毒性研究[J];化學與生物工程;2015年08期

本文編號：2701150