【摘要】：背景與目的腦膠質瘤是目前人類腫瘤中最為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%~40%,是生存時間最短及預后最差的疾病類型之一。隨著社會的發(fā)展,腫瘤已經(jīng)成為人類較為常見的疾病,腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病位居第二,是目前威脅人類健康最重要的疾病之一。盡管近年來隨著醫(yī)療水平的發(fā)展,手術治療、放射治療及藥物化療等常規(guī)治療手段取得了較大的進步,但由于腦膠質瘤浸潤生長的特性,導致腫瘤部位難以徹底切除而復發(fā),影響腦膠質瘤治療的預后,且目前診療腦膠質瘤的分子標記物仍然非常有限。近年來,隨著分子生物學認識的不斷深入,分子靶向逐漸成為治療腫瘤新的治療措施,其成為現(xiàn)代醫(yī)學腫瘤學治療的重要組成部分。人線粒體轉錄終止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3,hMTERF3)是一個負調控線粒體基因表達和氧化磷酸化活性的蛋白質。已有研究報道,hMTERF3基因拷貝數(shù)擴增及其過表達對肝細胞癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進展和預后有重要作用,但目前,關于hMTERF3在腦膠質瘤中的表達及其預后意義尚未見相關報道。本課題首先基于TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘并分析hMTERF3的表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系,探討hMTERF3表達水平與腦膠質瘤患者預后的相關性。通過免疫組織化學技術觀察hMTERF3蛋白在腦膠質瘤和非腫瘤性腦組織中的表達。構建及鑒定重組真核表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3,并利用生物信息學方法預測hMTERF3蛋白的結構與功能。進一步研究轉染重組真核表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3對腦膠質瘤U251細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體蛋白表達水平及其細胞增殖、細胞周期等生物學行為的影響。本研究將為闡明hMTERF3在腦膠質瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定實驗基礎,也為腦膠質瘤的診斷和治療提供潛在的分子靶標。方法利用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索關于hMTERF3基因的信息,并對hMTERF3基因在腦膠質瘤中的表達進行薈萃分析;利用Bioconductor/TCGA biolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載臨床資料數(shù)據(jù),使用R3.3.0軟件對TCGA數(shù)據(jù)庫中526例腦膠質瘤患者的臨床病理參數(shù)與hMTERF3表達水平進行相關性分析。使用Graphpad 5.0軟件對TCGA數(shù)據(jù)集中高表達hMTERF3和低表達hMTERF3的腦膠質瘤患者的預后生存進行Kaplan-Meier分析。同時,在大理州人民醫(yī)院收集2008~2012年的20例腦膠質瘤組織及16例非腫瘤性腦組織標本進行免疫組化。20例腦膠質瘤患者中男性13例,女性7例,年齡14~62歲,均為首次確診,手術前未經(jīng)化療、放療。采用免疫組織化學方法檢測上述標本中hMTERF3蛋白的表達情況,并比較其表達水平的差異;根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因序列設計引物,采用聚合酶鏈式反應從pGEM-hMTERF3重組克隆載體中擴增出hMTERF3基因開放閱讀框序列,經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后,連接入真核表達載體p3×FLAG-CMV-14的多克隆位點中,構建重組質粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3,分別用菌落PCR、限制性核酸內切酶和DNA序列分析3種方法鑒定重組子;利用不同的生物信息學軟件對hMTERF3蛋白進行系統(tǒng)研究,包括hMTERF3的理化性質、二級結構功能域、亞細胞定位、同源蛋白多重序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構建及三級結構同源建模;采用半定量PCR和Western blot檢測過表達hMTERF3對腦膠質瘤U251細胞線粒體DNA拷貝量變化、線粒體編碼蛋白的表達水平。采用流式細胞術和MTT法檢測過表達hMTERF3對細胞周期及細胞增殖的影響。結果1、利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),hMTERF3在腦膠質瘤組織中呈現(xiàn)高表達。TCGA數(shù)據(jù)庫中下載得到526例腦膠質瘤患者的臨床病理資料,通過使用R軟件分析結果顯示,hMTERF3的表達與年齡(P=0.010)、腫瘤原發(fā)部位(P=0.048)、幕上定位(P=0.041)、等級(P0.001)及病理類型(P0.001)明顯相關。而與性別、發(fā)病部位、頭痛史、樣本類型無關(均P0.05)。進一步利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析hMTERF3表達對腦膠質瘤患者生存時間的影響發(fā)現(xiàn),hMTERF3高表達組的OS(P=0.001,HR=2.03)及DFS(P=0.004,HR=1.54)均低于hMTERF3低表達組,兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義。多因素分析結果顯示,年齡、腫瘤原發(fā)部位等均是影響腦膠質瘤患者預后的獨立預后因素(P0.05)。免疫組化分析表明,hMTERF3蛋白在腦膠質瘤組織中高表達,而在非腫瘤性腦組織中低表達,在腦膠質瘤組織中hMTERF3蛋白的表達主要定位在細胞質中,呈淺黃色或棕黃色染色。其中腦膠質瘤組織中hMTERF3蛋白的陽性表達較強,染色較深,而在非腫瘤性腦組織中也可觀察到hMTERF3蛋白的表達,但染色較淺。2、利用不同的生物信息學軟件對hMTERF3蛋白進行系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn),hMTERF3蛋白的二級結構主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲,同時包含6個MTERF基序,三級結構預測結果與二級結構預測結果相一致;亞細胞定位結果顯示,該蛋白定位于人線粒體內;同源蛋白多重序列比對和進化分析顯示,該蛋白與大鼠、小鼠等哺乳動物的MTERF3蛋白具有高度的同源性,且親緣關系更近。重組質粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定均獲得大小為1254bp的目的條帶,DNA序列分析結果表明該序列與GenBank中hMTERF3基因序列的同源性達到100%,插入基因的大小和方向均正確。3、轉染腦膠質瘤U251細胞后通過半定量PCR檢測線粒體DNA拷貝量發(fā)現(xiàn),過表達hMTERF3對線粒體DNA的復制起顯著抑制作用;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)hMTERF3過強表達會降低線粒體編碼的ND1蛋白水平;MTT檢測結果顯示,過表達hMTERF3促進U251細胞的增殖;流式細胞術分析細胞周期發(fā)現(xiàn),hMTERF3過強表達能促進細胞增殖,并導致細胞順利通過G1/S控制點,細胞周期未出現(xiàn)阻滯和凋亡。結論1、研究表明,基于TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫獲取腦膠質瘤組織中hMTERF3表達的相關信息,為深入研究hMTERF3在腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。免疫組化檢測hMTERF3蛋白在人腦膠質瘤中的表達增高,提示hMTERF3可能參與人腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展,并且可能與腫瘤的惡性程度密切相關。2、成功構建hMTERF3基因的真核表達載體,為進一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎;利用不同的生物信息學軟件分析該蛋白的結構,這為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎。3、在腦膠質瘤U251細胞中過表達hMTERF3顯著抑制線粒體DNA的復制水平,并且影響線粒體編碼ND1蛋白質的表達水平。同時過表達hMTERF3能顯著促進U251細胞增殖,促進細胞周期G0/G1期向S期的轉變進程,并且不導致細胞凋亡。
【圖文】：

鏈和輕鏈復制起點（箭頭表示方向），黃色方框表A 和編碼蛋白的基因。圖 1-1. 人線粒體 DNA 結構圖 為雙鏈閉合環(huán)狀，，外環(huán)稱重鏈(H)，內環(huán)稱于兩條鏈所含有的核苷酸不同所引起的，重A 分子量較大，而輕鏈胞嘧啶所占比重較多編碼氧化磷酸化呼吸鏈復合體亞基上的 12 種，而輕鏈只編碼氧化磷酸化呼吸鏈復合體亞NA。線粒體 DNA 上的基因排列非常緊湊，一小段 D 環(huán)區(qū)(displacement loop)無基因編碼含有線粒體 DNA 復制及轉錄所需要的調控序uence box, CSB)、復制相關的終止結合序列（和線粒體 DNA 轉錄的啟動子序列[12,13]。線，重鏈上 2 個(HSP1,HSP2)及輕鏈上 1 個(LS

高遷移蛋白家族(HMG)。在線粒體DNA的復制、轉錄和揮重要的作用[28,29]。線粒體轉錄因子B(TFB1M,TFB2M)重要調控因子，由核基因編碼通過特殊的方式轉運到線TFB2M與線粒體RNA聚合酶（POLRMT）形成異源二啟動子開始轉錄[30]。轉錄終止因子(mitochondrial transcription termination fact因編碼通過特殊的方式轉運到線粒體，并能與mtDNA在線粒體DNA的復制、轉錄以及翻譯中發(fā)揮調控作用[發(fā)現(xiàn)，線粒體轉錄終止因子蛋白家族有4個成員(MTETERF2僅存在于脊柱動物中，而MTERF3和MTERF4在都存在，并且它們之間都含有亮氨酸拉鏈樣結構和與m蛋白家族主要的特征是：定位于線粒體和存在不定重復數(shù)氨基酸折疊而成的亮氨酸拉鏈結構）。
【學位授予單位】：大理大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2681608