【摘要】：朊病毒病,又稱可傳播性海綿狀腦病,是一類可引起人和動物中樞神經系統(tǒng)退行性病變的致死性疾病。朊病毒病的致病因子是一種具有致病性的異常朊蛋白,又稱為朊病毒。該蛋白由細胞內正常表達的朊蛋白發(fā)生蛋白錯誤折疊轉變而來,具有去污劑不溶性、自我復制能力和有限的蛋白酶K抗性。朊病毒可引起人類克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、致死性家族性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)、吉斯特曼-斯特勞斯綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome, GSS)以及庫魯病(Kuru)。其中CJD又分為散發(fā)型CJD(sporadic CJD, sCJD)、遺傳型CJD (genetic CJD, gCJD)、醫(yī)源型CJD (iatrogenic CJD, iCJD)和變異型CJD (variant CJD, vCJD)四種。朊病毒亦可感染動物,引起麇鹿的慢性消耗性疾病、羊的瘙癢癥、牛的海綿狀腦病(瘋牛病)。朊病毒病的典型神經病理學改變包括腦組織中出現淀粉樣斑塊沉積、海綿狀空泡樣變性、神經元丟失及膠質細胞增生。Wnt信號通路是一種廣泛存在于真核生物中進化高度保守的信號通路。Wnt信號通路在細胞生長、發(fā)育、更新、代謝及遷移等生理過程中起到至關重要的作用。Wnt信號通路可被19種Wnt配體所激活,按細胞中信號傳導是否有β連環(huán)蛋白(p-catenin)參與,可將其分為經典Wnt信號傳導通路(Wnt/β-catenin信號通路)和非經典Wnt信號通路,后者又可分為細胞極性通路(Planar cell polarity pathway, PCP)和Wnt/Ca2+信號通路,其中經典Wnt信號通路研究最為廣泛。Wnt信號通路在神經元再生及突觸發(fā)生等生理過程中起到重要的調節(jié)作用。研究表明,Wnt信號通路的失調與許多神經退行性疾病的發(fā)病機制相關,如阿爾茨海默癥和帕金森病,而在朊病毒病中未見報道。本研究首先以羊瘙癢因子小鼠適應株139A和ME7感染的小鼠腦組織為研究對象,研究朊病毒感染過程中經典Wnt信號通路的變化情況。通過Western blot方法檢測到羊瘙癢因子毒株139A和ME7感染終末期的小鼠腦組織中Ser33,Ser37及Thr4’磷酸化β-catenin的表達明顯高于正常對照小鼠。同時對經典Wnt信號通路轉錄調控的下游靶基因cyclin D1的檢測發(fā)現139A及ME7感染終末期的小鼠腦組織中cyclin D1表達下調。提示在朊病毒感染終末期的小鼠腦組織中經典Wnt信號通路被抑制。由于GSK-3p可使β-catenin磷酸化,但GSK-3β的Ser9磷酸化后可使自身失活喪失,因此我們檢測了GSK-3β和Ser9磷酸化GSK-3β的水平變化,結果顯示與正常C57BL/6小鼠相比,139A及ME7感染終末期的小鼠腦組織中Ser9磷酸化的GSK-3β與總GSK-3β的比值明顯減低,提示朊病毒感染終末期的小鼠腦組織中GSK-3β的活性明顯增加。通過對經典Wnt信號通路中的信號分子Wnt-3和正調控分子Dvl-3的蛋白表達水平檢測發(fā)現,與正常對照相比,139A及ME7感染終末期小鼠腦組織中Wnt-3蛋白的表達下調,而Dvl-3與對照組小鼠腦組織中的表達水平相近。應用Western blot方法檢測通路中的負調控分子DKK-1蛋白表達水平發(fā)現,139A及ME7毒株感染終末期的C57BL/6小鼠腦組織中DKK-1的蛋白表達明顯升高。進一步應用免疫組織化學方法在朊病毒感染的小鼠皮層及小腦區(qū)域檢測到大量的DKK-1陽性細胞,同時免疫組織熒光結果顯示,DKK-1蛋白主要在小鼠神經元中表達。選取感染羊瘙癢因子139A及ME7毒株不同時間點的小鼠腦組織,檢測經典Wnt信號通路相關蛋白的動態(tài)變化。結果顯示,在羊瘙癢因子感染的過程中,隨著潛伏期的不斷延長,經典Wnt信號通路逐漸被抑制。本研究隨后又以穩(wěn)定感染朊病毒Chandler毒株的小鼠神經瘤細胞系SMB-S15及經硫酸戊聚糖(pentosan sulfate, PS)治療清除prpSc的細胞對照SMB-PS為研究對象。與對照細胞SMB-PS相比,SMB-S15細胞中,靶基因cyclin D1、c-myc及survivin的mRNA水平明顯下降。對細胞模型中經典Wnt信號通路的蛋白變化檢測顯示,與SMB-PS相比,SMB-S15中Ser33, Ser37, Thr41磷酸化β-catenin的表達明顯上調,Ser9磷酸化GSK-3p;表達水平明顯下調,cyclin Dl蛋白表達明顯下調。我們對正調控分子Wnt-3、Dvl-3及負調控因子DKK-1蛋白進行了Western blot檢測,結果顯示,與對照細胞SMB-PS相比,SMB-S15細胞中Wnt-3和Dvl-3的表達下調。而SMB-PS細胞中DKK-1的表達明顯高于SMB-S15細胞。本研究分別從體內水平和體外水平分別證實了朊病毒感染中經典Wnt/p-catenin信號通路被抑制。
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為研究對象，為確保化病毒感染的ＳＭＢ－Ｓ１５細胞中ＰｒｐＳｅ的存在，將提取的細胞逡逑裂解液用終濃度為２５邋＾１３／１１１１＾的蛋白酶１＾邋３７°（：消化１邋ｈ，，然后進行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑檢測，一抗為ＰｒＰ特異性單克隆抗體６Ｄｌｌ。如圖８所示，經２５＾ｉｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ逡逑消化后，ＳＭＢ－Ｓ１５細胞中檢測到可抵抗蛋白酶Ｋ消化的ＰｒｐＳｅ條帶，而ＳＭＢ－ＰＳ逡逑細胞中無ｈｐｓｅ條帶。逡逑ＰＳ邐Ｓ１５逡逑ＰＫ邐￣－邐＋■邐￣邐￣逡逑＾３邐—巧邋ｋＤａ逡逑ｍｍ逡逑—巧帕３逡逑Ｂ邋＾逡逑Ｈｕｌｌ逡逑楩哪眼＿巧…。逡逑圖８．邋ＳＭＢ－Ｓ１５及ＳＭＢ－ＰＳ細胞中ＰｒｐＳｔ的檢n,逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋８．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋化＃rP校潁穡櫻澹rP椋睿rP櫻停攏

本文編號：2660410