【摘要】：背景:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤,其特征是具有局部彌漫浸潤的高侵襲性,并始終保持較差的預(yù)后。然而,目前僅有極少數(shù)可靠的生物標志物可用于預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的疾病進程、治療反應(yīng)和結(jié)局。已有研究顯示高端粒酶活性或hTERT啟動子突變與人腦腫瘤的臨床診斷及預(yù)后參數(shù)密切相關(guān)。有也研究提出,與腫瘤組織病理學(xué)和臨床參數(shù)相關(guān)聯(lián),hTERT可變剪接體的表達可作為某些癌癥患者的診斷或預(yù)后生物標志物。同時,端粒酶也因此成為癌癥治療的一個有吸引力的靶點,并且hTERT可變剪接模式的調(diào)節(jié)將是一種治療策略。隨著活性hTERT m RNA轉(zhuǎn)錄體表達水平下降,端粒酶活性會降低。但hTERT可變剪接體的生物學(xué)功能和精確調(diào)控機制仍不清楚。研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和反義寡核苷酸處理改變了hTERT前體mRNA的剪切模式,可以抑制端粒酶活性。另一項研究證實,一種G-四鏈體配體12459可以在A549細胞中將hTERT-FL轉(zhuǎn)換為β缺失hTERT轉(zhuǎn)錄體而降低端粒酶活性。在端粒單鏈懸端或c-myc基因啟動子序列中已經(jīng)廣泛研究了G-四鏈體結(jié)構(gòu),并且證實了hTERT內(nèi)含子6含有兩個能夠形成G-四鏈體的富含G的序列。同樣,CX-5461作為rDNA轉(zhuǎn)錄抑制劑目前處于惡性腫瘤的I期臨床試驗中,據(jù)報道它能強烈地結(jié)合和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)并能在體外誘導(dǎo)ATM/ATR,DNA損傷。此外,BRACO-19和TMPyP4作為其他兩種G-四鏈體配體在穩(wěn)定G-鏈體結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)端粒DNA損傷方面被廣泛研究,也具有調(diào)節(jié)hTERT可變剪接模式的潛力。因此,我們首先分析hTERT可變剪接體及端粒酶活性對膠質(zhì)瘤患者診斷及預(yù)后評估的價值。然后探究G-四鏈體配體對膠質(zhì)母細胞瘤細胞系hTERT可變剪接模式的調(diào)節(jié)潛能,并進一步研究CX-5461對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生物學(xué)功能。目的:用人膠質(zhì)瘤樣本及人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系來研究端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因可變剪接的臨床意義及G4鏈配體CX-5461對其調(diào)控機制。方法:1、收集、凍存膠質(zhì)瘤樣本并整理臨床資料與病理資料。2、對收集的膠質(zhì)瘤樣本及人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系總RNA提取并逆轉(zhuǎn)錄建立cDNA文庫。3、通過RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤樣本及細胞系hTERT可變剪接體的表達并分析其臨床意義。4、通過TRAP實驗檢測膠質(zhì)瘤樣本及細胞系端粒酶活性并分析其臨床意義。5、通過免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測膠質(zhì)母細胞瘤細胞相關(guān)蛋白的表達變化。6、通過MTT檢測CX-5461對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的抑制率。7、通過細胞克隆實驗檢測CX-5461對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖的影響。8、通過流式細胞術(shù)檢測CX-5461對膠質(zhì)母細胞瘤細胞周期及凋亡的影響。9、通過免疫熒光方法檢測細胞端粒DNA損傷相關(guān)蛋白熒光強度。結(jié)果:1、RT-PCR結(jié)果顯示hTERT-All在所有人類膠質(zhì)瘤組織和細胞系中均有表達,hTERT-FL mRNA在約86.8%的GBM,73.9%的ODM和42.9%的OAM中可檢測到。在膠質(zhì)瘤瘤組織中檢測到兩種hTERT可變剪接體(hTERT+β和hTERT-β)。38例GBM病例中有33例,24例ODM中有17例,35例OAM中有15例表達hTERT+β轉(zhuǎn)錄體,其余31例僅表達出無功能hTERT-β轉(zhuǎn)錄體。hTERT+β轉(zhuǎn)錄體與hTERT-FL轉(zhuǎn)錄體的表達一致。當hTERT+β轉(zhuǎn)錄體與患者的臨床變量相關(guān)聯(lián)時,其存在與患者的年齡,KPS,腫瘤大小和WHO腫瘤等級顯著相關(guān)(P0.05)。2、TRAP法檢測96例膠質(zhì)瘤組織標本,結(jié)果顯示38例GBM患者腫瘤組織中有34例(89.5%),23例ODM患者腫瘤組織中有17例(73.9%),35例OAM患者腫瘤組織中16例(45.7%)表現(xiàn)出較高的端粒酶活性。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,三種不同組織類型的膠質(zhì)瘤端粒酶活性與hTERT-FL或hTERT+β轉(zhuǎn)錄體的表達一致。TA與患者性別或切除范圍無關(guān)(P0.05)。而與患者年齡,腫瘤大小,KPS和WHO分級等顯著相關(guān)(P0.05)。在年齡50歲的52例患者中有30例(57.7%)端粒酶活性陽性,而年齡≥50歲的44名患者中有37例(84.1%)端粒酶活性陽性。在腫瘤6cm的49例患者中有28例(57.1%)端粒酶活性陽性,而腫瘤≥6cm的47例患者中有39例(83%)端粒酶活性陽性。在KPS75的57例患者中有39例(59.6%)端粒酶活性陽性,而KPS≥75的39例患者中有33例(84.6%)端粒酶活性陽性。3、Kaplan-Meier評估顯示,38例GBM患者表達hTERT+β的3年中位生存期為11.5個月,僅表達hTERT β的3年中位生存期為24個月;TA陽性患者的3年中位生存期為12個月,TA陰性患者的3年中位生存期為25個月。23例ODM患者表達hTERT+β或TA陽性的3年中位生存期為19個月,僅表達hTERT β或TA陰性的3年中位生存期為35個月。35例OAM患者表達hTERT+β的3年中位生存期為28個月,僅表達hTERT β的3年中位生存期為36個月;TA陽性患者的3年中位生存期為29個月,TA陰性患者的3年中位生存期為36個月。對于不同WHO組織級別膠質(zhì)瘤缺乏hTERT+β轉(zhuǎn)錄體表達或TA的患者存在顯著的生存獲益(P0.05)。4、RT-PCR結(jié)果顯示,CX-5461能夠顯著改變hTERT剪接模式,導(dǎo)致T98G和U251細胞中活化的hTERT+β轉(zhuǎn)錄體急劇下降(P0.05)。另外兩個G-四鏈體配體TMPyP4和BRACO-19作用不顯著。在T98G和U251細胞中,CX-5461可以導(dǎo)致活化的hTERT+β轉(zhuǎn)錄體以劑量依賴性方式逐漸減少,并且增加非活性的hTERT-β轉(zhuǎn)錄體的表達(P0.05)。CX-5461可以劑量依賴性方式導(dǎo)致hTERT-FL表達的顯著降低(P0.05),而對hTERT-All表達沒有明顯影響(P0.05)。5、Western blot結(jié)果顯示,CX-5461在T98G和U251細胞中僅能微弱下調(diào)hTERT蛋白表達,條帶灰度值統(tǒng)計分析顯示這種調(diào)控不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)TRAP實驗結(jié)果顯示,CX-5461可以以劑量依賴性的方式抑制T98G和U251細胞端粒酶活性。6、MTT結(jié)果顯示,濃度為0.05到25μM的CX-5461作用48小時后,T98G,U251對CX-5461表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性細胞毒性效應(yīng)。C6細胞系對CX-5461表現(xiàn)出中等強度的劑量依賴性細胞毒性效應(yīng)。而HEB細胞對CX-5461表現(xiàn)出的細胞毒性反應(yīng)很弱。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,T98G,U251細胞的克隆數(shù)目隨CX-5461藥物濃度的增加而呈梯度顯著減少(P0.05)。7、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,CX-5461可誘導(dǎo)T98G和U251細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。Western blot結(jié)果顯示CX-5461能夠明顯上調(diào)p53和p16蛋白的表達,而抑制cyclin D1蛋白的表達。8、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示CX-5461可誘導(dǎo)T98G和U251細胞發(fā)生細胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示CX-5461能夠顯著降低T98G和U251細胞Bcl-2的表達,同時上調(diào)cleaved caspase-3和Bax的活性。9、Western blot結(jié)果顯示CX-5461可以誘導(dǎo)T98G和U251細胞γ-H2AX,53BP1和p-ATM表達明顯上調(diào)。共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光雙染細胞核中DNA損傷反應(yīng)標志物γ-H2AX和p-ATM結(jié)果顯示,CX-5461可以誘導(dǎo)T98G和U251細胞表達γ-H2AX和p-ATM并能與TRF1充分實現(xiàn)共定位,證明細胞DNA損傷反應(yīng)發(fā)生在端粒DNA上。結(jié)論:1、人膠質(zhì)瘤存在兩種hTERT可變剪接體即hTERT+β和hTERT-β,hTERT+β可變剪接體與hTERT-FL可變剪接體表達一致,并且與高端粒酶活性相一致,有作為提示膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的生物標志的潛能。2、G-四鏈體配體CX-5461能夠改變hTERT剪接模式,導(dǎo)致GBM細胞活化的hTERT+β及hTERT-FL表達下降,抑制GBM細胞端粒酶活性。3、G-四鏈體配體CX-5461對GBM細胞具有細胞毒性作用,可引起端粒DNA損傷反應(yīng),誘導(dǎo)GBM細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯及發(fā)生細胞凋亡。
【圖文】：

All 在所有人類膠質(zhì)瘤組織和細胞系中均有表達（圖 4.1，圖 4.2然后，我們使用 hTERT-FL mRNA 特有的一對引物，通過使行 PCR 分析。結(jié)果顯示，，hTERT-FL mRNA 在約 86.8％的 GBM（ ODM（圖 4.3）和 42.9％的 OAM（圖 4.4）中可檢測到。此外，在 h的 96 膠質(zhì)瘤組織中，hTERT 可變剪接變體表達被進一步研究。（圖 4.2, 4.3, 4.4），在腫瘤組織中檢測到兩種 hTERT 可變剪接體ERT-β）。然而，在所有人膠質(zhì)瘤組織或 GBM 細胞系中未檢測到α 38 例 GBM 病例中有 33 例（圖 4.2），24 例 ODM 中有 17 例（M 中有 15 例（圖 4.4）表達 hTERT+β轉(zhuǎn)錄體，其余 31 例僅表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄體。我們發(fā)現(xiàn)，hTERT+β轉(zhuǎn)錄體與 hTERT-FL 轉(zhuǎn)錄體的表達hTERT +β轉(zhuǎn)錄體與患者的臨床變量相關(guān)聯(lián)時，發(fā)現(xiàn)其存在與患者瘤大小和 WHO 腫瘤等級顯著相關(guān)（表 3.1）。這些發(fā)現(xiàn)表明 表達與膠質(zhì)瘤的迅猛生長相關(guān)。

圖 4.2 膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤組織 hTERT 可變剪接體表達Figure 4.2 hTERT alternative splice variant patterns in GBMs. Thirty-three of38 (86.8%) GBM cases exhibited hTERT +β transcript, and the remaining cases onlyexhibited nonfunctional hTERT β transcript. Cases with hTERT +β transcript wereconsistent with the expression of hTERT-FL transcript.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2658637