本文關鍵詞：RNF213基因對煙霧病相關致病因子作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討SD大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中RNF213基因對VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9基因表達的影響,明確RNF213基因量變在煙霧病發(fā)病過程中的作用。內容:收集濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科和神經(jīng)內科2014年9月至2015年4月間入院的煙霧病患者以及體檢中心健康人的血清,用Elisa方法分別檢測煙霧病患者組以及健康人對照組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,比較兩組間相關因子含量的差異。分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞以達到純化的目的,應用流式細胞術和成骨、成脂誘導分化進行鑒定。分別將RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重組質粒轉染第3代rBMSCs,通過RT-qPCR技術檢測RNF213-shRNA對VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA表達的影響。方法:通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa)方法檢測煙霧病組和健康人對照組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的含量,用SPSS19.0分析兩者血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9表達量的差異。應用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)rBMSCs進行純化,并通過流式細胞術和成骨、成脂方向誘導分化對純化后的第3代rBMSCs進行鑒定。選用第3代rBMSCs作為細胞實驗對象,分別將RNF213-shRNA和Negative-shRNA慢病毒重組質粒對第3代細胞進行轉染,將實驗分為A組(轉染RNF213-shRNA慢病毒的rBMSCs組)、B組(轉染Negative-shRNA慢病毒的rBMSCs組)、C組(未轉染的rBMSCs組),應用RT-qPCR技術檢測慢病毒的轉染效率以及三組rBMSCs轉染慢病毒7天和15天時VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA的表達情況。結果:1.與健康人對照組相比,煙霧病組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表達水平均明顯升高,兩組間差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.分離純化的第3代rBMSCs細胞表面高表達CD90(95.15%)和CD44(99.23%),低表達CD45(0.74%)。成骨誘導21天后,用茜素紅進行染色,可見明顯的紅色致密鈣化結節(jié);成脂誘導14天后,用油紅O進行染色,可見胞內大量紅色脂滴形成。3.RNF213-shRNA慢病毒轉染效率鑒定結果顯示:相對于C組(未轉染rBMSCs組),A組、B組RNF213 mRNA的相對表達量分別為0.028±0.002、0.976±0.021,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.轉染后第7天RT-qPCR結果顯示:相對于C組,A組、B組VEGF mRNA的相對表達量分別為0.915±0.112、0.949±0.012,兩組之間相對表達量的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);A組、B組bFGF mRNA的相對表達量分別為0.964±0.023、0.958±0.035,兩組之間相對表達量的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);A組、B組TGF-β1mRNA的相對表達量分別為3.269±0.968、0.996±0.005,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01);A組、B組MMP-9 mRNA的相對表達量分別為3.147±0.320、0.946±0.052,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5.轉染后第14天RT-qPCR結果顯示:相對于C組,A組、B組VEGF mRNA的相對表達量分別為0.973±0.019、0.966±0.026,兩組之間相對表達量的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);A組、B組bFGF mRNA的相對表達量分別為1.582±0.272、0.966±0.039,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01);A組、B組TGF-β1 mRNA的相對表達量分別為2.370±0.068、0.974±0.019,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01);A組、B組MMP-9 mRNA的相對表達量分別為2.741±0.374、0.976±0.044,兩組之間相對表達量的差別具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結論:1.相對于健康人對照組,煙霧病組血清中VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9的表達水平均明顯升高,說明VEGF、bFGF、TGF-β1、MMP-9在煙霧病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。2.利用全骨髓貼壁法可成功分離SD大鼠骨髓間充質干細胞,第3代細胞可作為后續(xù)細胞實驗良好的種子細胞。3.RNF213-shRNA可有效抑制rBMSCs中RNF213基因的表達,RNF213基因的低表達可誘導bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的高表達。4.RNF213基因可能通過某種基因通路影響bFGF、TGF-β1、MMP-9基因的表達,從而使煙霧病患者體內bFGF、TGF-β1、MMP-9表達異常,說明RNF213基因量變在煙霧病發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。
【關鍵詞】：煙霧病 RNF213 骨髓間充質干細胞 血管內皮生長因子 堿性成纖維生長因子 轉化生長因子 β1 基質金屬蛋白酶 9
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-17
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、煙霧病患者血清中相關因子的表達17-26
• 1.1 對象和方法17-20
• 1.1.1 研究對象17-18
• 1.1.2 實驗試劑和耗材18
• 1.1.3 實驗儀器18-19
• 1.1.4 研究方法19
• 1.1.5 數(shù)據(jù)處理19-20
• 1.2 結果20-23
• 1.3 討論23-25
• 1.4 小結25-26
• 二、骨髓間充質干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定26-37
• 2.1 對象和方法26-30
• 2.1.1 研究對象26
• 2.1.2 實驗試劑和耗材26-27
• 2.1.3 實驗儀器27
• 2.1.4 研究方法27-30
• 2.1.5 數(shù)據(jù)處理30
• 2.2 結果30-34
• 2.2.1 骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學特征30-31
• 2.2.2 骨髓間充質干細胞傳代細胞成活率測定31
• 2.2.3 骨髓間充質干細胞傳代細胞貼壁率測定31
• 2.2.4 骨髓間充質干細胞生長曲線測定31
• 2.2.5 流式細胞術鑒定骨髓間充質干細胞31
• 2.2.6 成骨誘導分化鑒定骨髓間充質干細胞31-32
• 2.2.7 成脂誘導分化鑒定骨髓間充質干細胞32-34
• 2.3 討論34-36
• 2.4 小結36-37
• 三、RNF213-shRNA轉染與相關因子mRNA表達檢測37-49
• 3.1 對象和方法37-40
• 3.1.1 實驗試劑37-38
• 3.1.2 實驗儀器38
• 3.1.3 實驗分組38
• 3.1.4 轉染方法38
• 3.1.5 RT-qPCR檢測轉染效率38-40
• 3.1.6 RT-qPCR檢測細胞內相關因子mRNA表達的變化40
• 3.1.7 數(shù)據(jù)處理40
• 3.2 結果40-44
• 3.2.1 RNF213-shRNA對RNF213 mRNA表達的影響40-41
• 3.2.2 RNF213-shRNA對細胞內相關因子mRNA表達的影響41-44
• 3.3 討論44-48
• 3.3.1 RNA干擾技術與慢病毒載體44-45
• 3.3.2 RNF213基因與煙霧病45-48
• 3.4 小結48-49
• 結論49-51
• 參考文獻51-56
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明56-57
• 綜述 煙霧病病因及發(fā)病機制的研究進展57-65
• 綜述參考文獻62-65
• 致謝65-66
• 個人簡歷66

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