【摘要】：目的:研究M2型巨噬細胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,AS)活化致膠質(zhì)瘢痕形成的內(nèi)在機制,為進一步探尋中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的機制以及治療新策略研究提供理論和實驗依據(jù)。方法:(1)大鼠AS的分離、培養(yǎng)與鑒定:新生(3天)SD乳鼠10只,麻醉處死,迅速取出脊髓,解剖鏡下剝除脊髓外膜,剪碎后的脊髓組織采用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液,差速貼壁法純化AS;采用免疫化學發(fā)光法檢測第3代AS的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達作為細胞純度鑒定,P3代AS用于后續(xù)實驗。(2)大鼠骨髓巨噬細胞(Mφ)的分離、培養(yǎng)與誘導分化為M2型巨噬細胞:SD大鼠5只(200-250 g),10%水合氯醛麻醉處死(0.4 mL/100 g),無菌環(huán)境下取出下肢股骨和脛骨的骨髓細胞,用含20%L929細胞條件培養(yǎng)基(L929-CM)、15%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7天,獲得純化的M0型巨噬細胞;于培養(yǎng)第8天加入IL-4(20 ng/ml)和IL-10(20 ng/ml)誘導培養(yǎng)24 h,可得到M2型巨噬細胞;采用流式細胞術對M2型巨噬細胞的CD11b、CD206、Arg-1和iNOS表達進行表型鑒定。(3)M2型巨噬細胞與AS間接共培養(yǎng)及相關檢測分析:利用0.4μm孔徑的Transwell 6孔板共培養(yǎng),上室為巨噬細胞,下室為AS,2種細胞接種的細胞數(shù)均為1×10~5個/孔。實驗分為以下4組:M2型巨噬細胞+AS組,M2型巨噬細胞+TGF-β受體阻斷劑+AS組(TGF-β受體阻斷劑SB431542終濃度為100mmol/L),M2型巨噬細胞單純培養(yǎng)組和AS單純培養(yǎng)組。共培養(yǎng)48 h后采用熒光定量PCR(q-PCR)檢測各組M2型巨噬細胞TGF-β和血小板衍生因子(platelet derived growth factor,PDGF)以及各組AS細胞的GFAP、硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)(Neurocan)、IL-4和IL-13基因的mRNA表達變化;Western blot檢測各組AS的GFAP及CSPG(Neurocan)的蛋白表達情況;ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β的含量。結(jié)果:(1)免疫熒光檢測結(jié)果表明,分離培養(yǎng)的大鼠脊髓AS細胞胞漿中高表達GFAP,培養(yǎng)的P3代AS細胞的GFAP陽性表達細胞百分比高達(95.86±1.02)%。(2)流式細胞術鑒定結(jié)果表明,分離誘導的M2型細胞高表達CD11b、CD206和Arg-1,低表達iNOS,符合M2型巨噬細胞的表型特征。(3)q-PCR檢測結(jié)果顯示,M2型巨噬細胞+AS共培養(yǎng)組較單純AS細胞培養(yǎng)組中AS的GFAP、CSPG(Neurocan)和IL-13在基因表達水平均上調(diào)(P值均㩳0.05),IL-4表達無差異(P㧐0.05),且共培養(yǎng)組中M2型巨噬細胞TGF-β和PDGF的基因表達較單純M2型巨噬細胞培養(yǎng)組均明顯上調(diào)(P值均㩳0.05);但M2型巨噬細胞+TGF-β受體阻斷劑+AS組中AS的GFAP、CSPG(Neurocan)和IL-13表達水平低于M2型巨噬細胞+AS組(P值均㩳0.05),且前者中M2型巨噬細胞TGF-β和PDGF的基因表達較后者均明顯下調(diào)(P值均㩳0.05)。(4)Western blot檢測顯示,M2型巨噬細胞+AS組和M2型巨噬細胞+TGF-β受體阻斷劑+AS組中AS的GFAP和CSPG(Neurocan)在蛋白表達水平較單純AS培養(yǎng)組上調(diào)(P值均㩳0.05);但后者(含TGF-β受體阻斷劑組)中AS的GFAP和CSPG(Neurocan)表達水平低于前者(P值均㩳0.05)。(5)ELISA檢測結(jié)果顯示,M2型巨噬細胞分泌TGF-β的能力顯著高于AS;與M2組相比,M2+AS組和M2+TGF-βR阻斷劑+AS組培養(yǎng)上清液中TGF-β的濃度顯著升高;與M2+AS組相比,加有TGF-βR阻斷劑的共培養(yǎng)組上清液中TGF-β的濃度明顯下調(diào)(P值均㩳0.01)。結(jié)論:本研究通過體外實驗探討了大鼠來源M2型巨噬細胞對脊髓星形膠質(zhì)細胞的致纖維化作用,并初步闡明M2型巨噬細胞分泌TGF-β是活化星形膠質(zhì)細胞致膠質(zhì)瘢痕形成的內(nèi)在機制,這為進一步探尋中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的膠質(zhì)瘢痕形成的機制的研究和今后抗膠質(zhì)瘢痕治療新靶點的臨床轉(zhuǎn)化應用奠定實驗依據(jù)。
【圖文】：

21圖 1 分離培養(yǎng)的 AS 形態(tài)及免疫熒光染色鑒定注：A：培養(yǎng) 3 d 的 AS（×40）；B：培養(yǎng) 7 d 的 AS（×40）；C：P1 代 AS（×40）；D：P2代 AS（×40）；E：DAPI 細胞核染色（×100）；F：純化的大鼠 AS 經(jīng) GFAP 免疫熒光染色呈強陽性（×100）；G：E、F 重疊雙色圖片（×100）。2.2 M2 型巨噬細胞免疫表型檢測結(jié)果經(jīng)流式細胞術檢測表明本實驗誘導培養(yǎng)的 M2 型巨噬細胞高表達 CD11b、CD206 和 Arg-1，低表達 iNOS，符合 M2 型巨噬細胞表型，，可用于后續(xù)實驗。

共培養(yǎng)后M2型巨噬細胞與AS基因表達變化
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 楊琴;張志仁;姜曼;吳玉章;;小鼠巨噬細胞功能極化可塑性的初步探討[J];免疫學雜志;2013年02期

相關碩士學位論文 前1條

1 戴晨;弱激光對骨髓來源巨噬細胞極化水平的調(diào)控研究及對大鼠脊髓損傷的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2016年

本文編號：2631995